БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ, ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ
УНИВЕРСИТЕТИ, ЎСИМЛИК МОДДАЛАРИ КИМЁСИ
ИНСТИТУТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 14.07.2016.К/В/Т.13.01 РАҚАМЛИ ИЛМИЙ
КЕНГАШ
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ
МАТЧАНОВ АЛИМЖОН ДАВЛАТБОЕВИЧ
ЛАБДАН ДИТЕРПЕНОИДЛАРИ ҲОСИЛАЛАРИ СИНТЕЗИ,
ГЛИЦИРРИЗИН КИСЛОТАСИ ВА САМАРАЛИ ГЕМОСТАТИК ДОРИ
ВОСИТАЛАРИНИ ЯРАТИШ
02.00.10 – Биоорганик кимѐ
(кимѐ фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ - 2017
1
УДК.577.1:577.352.34
Докторлик диссертацияси автореферати мундарижаси
Оглавление автореферата докторской диссертации
Content of the abstract of doctoral dissertation
Матчанов Алимжон Давлатбоевич
Лабдан дитерпеноидлари ҳосилалари синтези, глицирризин
кислотаси ва самарали гемостатик дори воситаларини
яратиш............................................................................................................3
Матчанов Алимжон Давлатбоевич
Синтез производных лабдановых дитерпеноидов,
глицирризиновая кислота и разработка эффективных
гемостатических лекарственных препаратов.............................................31
Matchanov Alimjon Davlatboevich
Synthes of labdane diterpenoids, glycyrrhizic acid, and the
development of effective hemostatic drugs…………………………………59
Эълон қилинган ишлар рўйхати
Список опубликованных работ...
List of published works……………………………………………….... 86
2
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ, ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ
УНИВЕРСИТЕТИ, ЎСИМЛИК МОДДАЛАРИ КИМЁСИ
ИНСТИТУТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 14.07.2016.К/В/Т.13.01 РАҚАМЛИ ИЛМИЙ
КЕНГАШ
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ
МАТЧАНОВ АЛИМЖОН ДАВЛАТБОЕВИЧ
ЛАБДАН ДИТЕРПЕНОИДЛАРИ ҲОСИЛАЛАРИ СИНТЕЗИ,
ГЛИЦИРРИЗИН КИСЛОТАСИ ВА САМАРАЛИ ГЕМОСТАТИК ДОРИ
ВОСИТАЛАРИНИ ЯРАТИШ
02.00.10 – Биоорганик кимѐ
(кимѐ фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ - 2017
3
Докторлик диссертацияси мавзуси Ўзбекистон Республикаси Вазирлар
Маҳкамаси ҳузуридаги Олий аттестация комиссиясида 30.09.2014/В2014.5.К74 рақам
билан рўйхатга олинган.
Докторлик диссертацияси Биоорганик кимѐ институтида бажарилган. Диссертация
автореферати уч тилда (ўзбек, рус, инглиз) Илмий кенгаш веб-саҳифаси
(http://ss.biochem.uz) ва «ZiyoNet» таълим ахборот тармоғида (www.ziyoNet.uz)
жойлаштирилган.
Илмий Далимов Давранбек Нигманович
маслаҳатчи:
кимѐ фанлари доктори, профессор
Расмий
оппонентлар: Азизов Умархон Мухтарович
кимѐ фанлари доктори, профессор
Дусматов Азиз Файзаматович
фармацевтика фанлари доктори, доцент
Абдулладжонова Нодира Гуломжановна
кимѐ фанлари доктори
Етакчи ташкилот: Тошкент фармацевтика институти
Диссертация ҳимояси Биоорганик кимѐ институти, Ўзбекистон Миллий
университети, Ўсимлик моддалари кимѐси институти ҳузуридаги 14.07.2016./К/В/Т.13.01
рақамли Илмий кенгашнинг 2017 йил «___» феврал соат ___ да ўтадиган мажлисида
бўлади (Манзил: 100125, Тошкент ш., Мирзо Улугбек кўч., 83.Тел.: 262 35 40, факс:
(99871) 262 70 63).
Диссертация билан Биоорганик кимѐ институти Ахборот-ресурс марказида танишиш
мумкин (Манзил: 100125, Тошкент ш., Мирзо Улугбек кўч., 83.Тел.: 262 35 40, факс:
(99871) 262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru).
Автореферат 2017 йил «____» февралда тарқатилди.
(2017 йил ____ феврал №____ рақамли реестр баѐнномаси)
Ш.И.Салихов
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш раиси, б.ф.д., академик
М.И.Асраров
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш илмий котиби, б.ф.д., профессор
А.А.Ахунов
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш ҳузуридаги илмий семинар раиси,
б.ф.д., профессор
4
КИРИШ (Докторлик диссертацияси аннотацияси)
Диссертация мавзусининг долзарблиги ва зарурати.
Бугунги кунда
дунѐда, жарроҳлик амалиѐтида диффузион қон кетишини тўхтатиш оғир
кечадиган жараѐнлардан бири бўлиб, 30% ҳолатларда беморларнинг ўлимга
сабаб бўлмоқда. Статистик маълумотларга кўра ер юзида ҳар йили турли хил
қон кетиши натижасида 30 миллионга яқин аҳоли ҳаѐтдан кўз юмади.
Мураккаб жарроҳлик амалиѐтидан кейинги бошланғич даврда қон кетиши
профилактикаси учун қиммат турадиган гемостатик дори воситалари зарур
бўлади. Адабиѐтлар таҳлили асосида, шуни таъкидлаш мумкинки, маҳаллий
ва вена орқали қўлланилиш таъсирга эга бўлган, ҳамда етарли даражадаги
ишончли самарали гемостатик препаратлари мавжуд эмас. Булар эса ўз
навбатида маҳаллий ва умумий таъсирга эга бўлган гемостатик воситаларни
излаб топиш долзарблигидан далолат беради.
Мустақиллик йилларида республикамизда маҳаллий ўсимликлар
асосида самарали дори воситаларини яратиш бўйича кенг қамровли чора
тадбирлар амалга оширилиб, муайян натижаларга эришилди. Бу борада
алкалоидлар, полифеноллар, изопреноидлар, стероидлар манбаии бўлган
шифобахш ўсимлик экстрактлари ва биологик фаол қуйи молекуляр
бирикмалар асосида яратилган самарали дори воситаларни (антиаритмия
хусусиятига эга бўлган «Аллапинин», қон тўхтатувчи «Лагоден», никотинга
қарши «Табекс», «Анабазин гидрохлорид», герпесга қарши «Мегосин»,
вирусга қарши «Рагосин») алоҳида таъкидлаш мумкин.
Бугунги кунда жаҳонда табиий бирикмалар ҳосилалари ва терпеноидлар
асосида янги гемостатик дори воситаларини яратиш долзарб вазифалардан
ҳисобланади. Бунда табиий ўсимлик манбалардан янги самарали дори
воситаларини ишлаб чиқиш бўйича тадқиқотларни амалга оширишда: янги
супрамолекуляр комплекс бирикмаларни олиш, янги гемостатик дори
воситаларини ишлаб чиқиш, ўсимликлардан биологик фаол бирикмаларни
ажратиб олиш, терпеноидларнинг физиологик фаоллигини ҳамда реологик
хусусиятларини аниқлаш, янги потенциал табиий биологик фаол
бирикмаларни топиш мақсадида тузилиш-фаоллик орасидаги ўзаро
боғлиқлигини
аниқлаш,
гемостатик
дори
воситаларининг
таъсир
механизмларини исботлаш кабилар долзарб мавзулардан ҳисобланади.
Ўзбекистон Республикаси Президентининг 2008 йил 15 июлдаги
ПҚ-916-сон
«Инновацион
лойиҳаларни
ва
технологияларни
мувофиқлаштириш учун қўшимча тадбирлар» Қарори ҳамда мазкур
фаолиятга тегишли бошқа меъѐрий-ҳуқуқий ҳужжатларда белгиланган
вазифаларни амалга оширишга ушбу диссертация тадқиқоти муайан
даражада хизмат қилади.
Тадқиқотнинг республика фан ва технологиялари ривожланиши
нинг устувор йўналишларига боғлиқлиги.
Мазкур тадқиқот республика
фан ва технологиялар ривожланишининг VI. «Тиббиѐт ва фармакология»
устувор йўналишига мувофиқ бажарилган.
5
Диссертация мавзуси бўйича хорижий илмий-тадқиқотлар шарҳи.
1
Биологик фаол терпеноидларни ўсимликлардан аниқлаш, ажратиб олиш,
уларнинг тузилиш ва фаоллик орасидаги боғлиқликни аниқлаш ва улар
асосида янги самарали гемостатиклар ишлаб чиқишга йўналтирилган илмий
изланишлар жаҳоннинг етакчи илмий марказлари ва олий таълим
муассасалари, жумладан, Department of Pharmacy Practice Southwestern
Oklahoma State University, (АҚШ). University of Mansoura (Миср), Shanghai
University of Traditional Chinese Medicin (Хитой), Бутунроссия дори
воситалари ва ароматик ўсимликлар институти (Россия), Ўсимлик моддалари
кимѐси институти, Миллий университетда (Ўзбекистон) олиб борилмоқда.
Ўсимликлардан биологик фаол терпеноидларни ажратиб олиш,
кимѐвий тузилиши ва фаолликлари, улар асосида янги самарали
гемостатиклар ишлаб чиқишга оид жаҳонда олиб борилган тадқиқотлар
натижасида қатор, жумладан, қуйидаги илмий натижалар олинган: ўсимлик
хом ашѐси асосида маҳаллий гемостатик препаратлари ишлаб чиқилган ва
уларнинг самарадорлиги ва хавсизлиги баҳоланган (Department of Pharmacy
Practice Southwestern Oklahoma State University, АҚШ); синтетик бирикма - н
бутил-2- цианоакрилат юз-чакка хирургиясида қон тўхтатувчи восита
сифатида қўлланилган (University of Mansoura, Миср);
Lagochilus ilicifolius
ўсимлигининг кимѐвий таркиби таҳлил қилинган, спектрал усул ѐрдамида 3
та аввал номаълум бўлган модда аниқланган (Shanghai University of
Traditional Chinese Medicin, Хитой); ширинмия ўсимлиги тритерпен
сапонинлари, глицирризин кислотаси ва унинг ҳосилалари ва турли
флавоноидлар асосида супрамолекуляр комплекс бирикмалар олинган
(Бутунроссия дори воситалари ва ароматик ўсимликлар институти, Россия);
ширинмия илдизи сапонинлари ва флавоноидлари физик-кимѐвий ва
спектрал хусусиятлари аниқланган (Самара давлат тиббиѐт университети,
Россия).
Дунѐда доривор ўсимликлар таркибидан биологик фаол моддаларни
ажратиб олиш, уларнинг кимѐвий тузилиш-фаоллиги ҳамда терпеноидлар
асосида янги, самарали гемостатиклар ишлаб чиқиш бўйича қатор, жумладан,
қуйидаги устувор йўналишларда тадқиқотлар олиб борилмоқда: лабдан
дитерпеноидларини синтез қилиш ва биологик фаоллигини аниқлаш; янги
потенциал табиий биологик фаол бирикмаларни аниқлаш учун тузилиш
фаоллик орасидаги боғлиқликни исботлаш; гемостатик дори воситаларини
ишлаб чиқиш; комплекс бирикмаларнинг реологик хусусиятларини аниқлаш;
гемостатик дори воситаларининг таъсир механизмларини исботлаш.
Муаммонинг ўрганилганлик даражаси.
Lagochilus
ўсимлиги
қадимдан ўзининг шифобахш хусусиятлари билан машхур ва Шарқнинг
доривор ўсимликлари қаторидан жой олган.
Lagochilus
тури ичида кенг
тарқалгани
Lagochilus inebrians
- Лагохилус сархушлантирувчи ҳисобланади.
Унинг асосий таъсир этувчи моддаси лагохилин. Аммо ѐввоий ҳолда ўсувчи
1
http://lektrava.ru/encyclopedia/zaytsegub-opyanyayushchiy,
http://floruz.uz/content/lagochilus-pubescens-vved. http://www.niscair.res.in/Science
Communication/AbstractingJournals.
6
ўсимлик захирасидан нооқилона фойдаланиш оқибатида, у бугунги кунда
Қизил китобга киритилган.
Чет эл олимлари H.A. Scheraga, M. Khalili, A. Liwo, Y. Zhang, R.F.
Murray, H.W. Harper, D.K. Granner, P.A. Mayes, A.F. Gammermanлар
томонидан ҳайвонот ва ўсимлик манбааларидан ажратиб олинган ди-,
тритерпеноидларни аниқлаш, кимѐвий тузилиши ҳамда биологик фаоллигини
ўрганиш ишлари олиб борилган.
МДҲ давлатларида
Lagochilus inebrians
тури ўсимлиги таркиби,
лагохилин ҳосилалари тузилиши ҳамда биологик фаоллигини ўрганиш
ишлари С.П.Боткин, И.П.Павлов, Г.В.Лазуревскийлар томонидан олиб
борилган. Глицирризин кислотаси ва унинг тузлари асосида олинган
комплекс
бирикмаларнинг
физик-кимѐвий
хусусиятлари,
таъсир
механизмлари бўйича Г.А.Толстиков бошчилигидаги мактаб томонидан чуқур
илмий изланишлар олиб борилмоқда.
Республикамизда
И.Э.Акопов,
О.С.Содиқов,
Т.П.Пўлатова,
М.И.Икрамов, И.И.Ибрагимов, Т.Р.Абдурахманов, С.Ауелбеков, М.М.
Абрамов, У.Н.Зайнутдинов, Д.Н.Далимов каби олимларнинг ишларида
Lagochilus inebrians
ўсимлиги мукаммал кимѐвий таҳлил қилинган.
Лагохилиннинг миқдори ўсимликнинг ер устки қисмида бир хил
тақсимланмаганлиги, нисбатан кўпроқ баргида (1,98%), репродуктив
органларида (0,84—1,87%) ва энг кам миқдори шохларида (0,15%
ўсимликнинг қуруқ массасига нисбатан) миқдори аниқланган. Лагохилин
ҳосиласи, лагохирзин кислотасининг мононатрийли тузи асосида сувда
эрувчан, самарали «Лагоден» препарати яратилган. Бугунги кунда
республикамизда гемостатик дори воситалари ишлаб чиқарилмайди. Қон
тўхтатувчи препаратларнинг асосий тўплами хориждан олиб келинади.
Диссертация мавзусининг диссертация бажарилган илмий
тадқиқот муассасасининг илмий-тадқиқот ишлари билан боғлиқлиги.
Диссертация тадқиқоти Биоорганик кимѐ институти илмий-тадқиқот ишлари
режасининг П-15.20 «Маҳаллий ўсимлик хом-ашѐси асосида вена қон томири
ичига қўлланиладиган Лаговин препаратини ишлаб чиқиш ва яратиш» (2003-
2005), А-10-053 «Коллаген пленкалари асосида маҳаллий таъсир қилувчи
гемостатик дори воситасини ишлаб чиқиш ва яратиш» (2006-2008), ФА-А12-
Т175 «Яллиғланишга қарши «ГЛАС препарати, маҳаллий гемостатик
препарат Глилагинни дори шаклларини олиш технологиясини ишлаб чиқиш
(2009-2011), ИФА 2012-6-4 «Лаговин препаратининг олиш технологиясини
ўзлаштириш, клиник синовларини ўтказиш ва тажриба синов партиясини
ишлаб чиқиш» (2012-2014), ФА-И11-ТО11 «Глилагин препаратини дори
шакли технологиясини ўзлаштириш, ва лагохилинни олиш техник
шароитларини ишлаб чиқиш» (2015-2016) мавзусидаги амалий ва инновацион
лойиҳалар доирасида бажарилган.
Тадқиқотнинг мақсади
лабдан дитерпеноидлари синтези, глицирризин
кислотаси, унинг тузлари ва кичик молекулали полимерлар асосида
супрамолекуляр комплекс бирикмаларни олиш, физик-кимѐвий
7
хусусиятларини аниқлаш ҳамда янги гемостатик воситаларни ишлаб
чиқишдан иборат.
Тадқиқотнинг вазифалари
:
Lagochilus Inebrians
ўсимлигидан лагохилин дитерпеноидини ажратиб
олиш ва тозалаш, кимѐвий модификация қилиш ҳамда физик-кимѐвий
хусусиятларини аниқлаш;
глицирризин кислотасини ширинмия илдизидан ажратиб олиш ва
тозалаш, моноаммонийли тузини (МАСГК) олишнинг тажриба-саноат
регламентини ишлаб чиқиш ва тажриба партиясини олиш;
глицирризин кислотаси ва унинг моноаммонийли тузи асосида
лагохилин билан турли хил нисбатларда комплекс бирикмаларини олиш,
физик-кимѐвий, спектрал хусусиятларини ўрганиш ва сувли эритмаларининг
реологик хоссаларини, комплекс ҳосил қилувчи моддалар нисбатига
боғликлигини ва уларнинг таъсирлашиш кучлари табиатини аниқлаш;
синтез қилинган лагохилин ҳосилалари ва супрамолекуляр комплекс
бирикмаларнинг гемостатик хусусиятлари, комплекс ҳосил қилувчи
бирикмаларни тузилиш-фаоллик, тузилиш-нисбат орасидаги боғлиқлигини
аниқлаш мақсадида ва уларнинг ичидан энг фаол бирикмаларини чуқур
фармако-токсикологик изланишлар учун топшириш;
математик моделлаш усули ѐрдамида олинган моддаларнинг
структурасининг эҳтимоллиги юқори бўлган тузилишини аниқлаш; маҳаллий
хом-ашѐ асосида олинган субстанциялар учун лаборатория ва тажриба саноат
регламентлари лойиҳаларини ишлаб чиқиш; «Глилагин» ва «Лаговин»
субстанциялари ва дори шаклларини стандартлаш ҳамда уларнинг –
«Глилагин» таблетка ва Лаговин вена қон томири орқали юбориладиган дори
шаклларини ишлаб чиқиш; «Глилагин» ва «Лаговин» субстанцияларининг ва
дори шаклларининг вақтинчалик фармакопея мақолалари лойиҳаларини
ишлаб чиқиш ва ЎзР ССВ Дори воситалари ва тиббий техника сифатини
назорат қилиш Бош Бошқармасига тақдим этиш;
оригинал гемостатик дори воситалари сифатида ЎзР ССВга қарашли
шифохоналарида клиник синовларини ўтказиш учун зарур бўлган меъѐрий
техник хужжатларни тайѐрлаш ва клиник синовларни ўтказишга рухсат
олиш.
Тадқиқот объекти
сифатида
Lagochilus Inebrians
ва
Glycyrrhiza Glabra
ўсимликлари, глицирризин кислотаси, лагохилин ва унинг ацетил,
бензилиден ва изопропилиден ҳосилалари, N-поливинилпирролидон,
супрамолекуляр комплекслари олинган.
Тадқиқот предмети
биологик фаол бирикмаларнинг физик-кимѐвий,
реологик хусусиятлари, биологик фаоллиги ва дори шаклларини
стандартлаш, гемостатик дори препаратларини яратишдан иборат.
Тадқиқот
усуллари.
Диссертацияда
индивидуал
ди-
ва
тритерпеноидларни ажратиб олиш ва тозалаш учун экстракция усули, юқори
самарали суюклик хроматографияси, газ хроматографияси; янги олинган
моддаларнинг кимѐвий тузилишларини аниқлаш учун физик-кимѐвий таҳлил
8
усуллари:
ультрабинафша,
инфрақизил
спектроскопия,
ЯМР
спектроскопияси, Chem Office 9.0 ва Hyper Chem программаларига
асосланган
квант-кимѐвий изланиш усуллари; дори воситаларини
стандартлаш учун давлат фармакопея сифат назорати ва биологик усуллардан
фойдаланилган.
Тадқиқотнинг илмий янгилиги
қуйидагилардан иборат:
лагохилиннинг янги ароматик ацеталлари синтез қилинган ва охирги
маҳсулот унумига катализаторлар таъсири аниқланган;
лагохилиннинг ацетил ва изопропилиден ҳосилаларининг гемостатик
фаоллиги билан ўринбосарларнинг табиати ва эркин гидроксил гуруҳлари
сони орасидаги боғлиқлиги аниқланган;
глицирризин кислотаси ва унинг моноаммонийли тузи билан
лагохилиннинг янги комплекс бирикмалари олинган;
глицирризин кислотаси ва унинг тузлари билан лагохилиннинг
супрамолекуляр комплекс бирикмалари сувли эритмаларида мицелляр
тузилиш, турғунлик ва термодинамик хусусиятлари билан, комплекс ҳосил
қилувчи компонентлар нисбати ва уларнинг кимѐвий тузилишига боғлиқлиги
аниқланган;
комплекс бирикмаларнинг сувли эритмалари реологик хусусиятларини
аниқлаш орқали, дори воситасини мицелла ичига кириш жараѐни система
энергияси ютуғи билан бориши исботланган;
система энтропияси (мицеляр ҳосилалар ўз-ўзидан ташкилланиши),
меҳмон молекуласи тузилиши ва функционал хослигига боғлиқлиги,
глицирризин кислотаси молекулаларидан иборат мицеллаларнинг тузилиш
жараѐнига мувофиқлаштирувчи сифатида таъсир этиши исботланган.
Тадқиқотнинг амалий натижаси
қуйидагилардан иборат: 2 хил
турдаги гемостатик дори воситаларининг субстанцияси ва дори шакллари,
перорал қўллашга мўлжалланган (таблетка) ва вена қон томирига
юбориладиган (2мл ампулада 0,15% эритма) дори шакллари ишлаб чиқилган.
«Глилагин» ва «Лаговин» субстанциялари тажриба синов партиясини
олинган. «Глилагин-0,005г таблетка»си ва «0,15% Лаговин эритмаси» дори
шаклларини тажриба синов партиялари олиш йўлга қўйилган. Лаговин
(0,15% эритма) ва Глилагин (таблетка) дори шакллари учун клиник синовлар
ўтказишга рухсат олинган. Глицирризин кислотасини олишда оралиқ
маҳсулот ҳисобланган техник маҳсулотни олиш йўлга қўйилган.
Тадқиқот
натижаларининг ишончлилиги
уларнинг замонавий физик-кимѐвий
тадқиқот усулларини қўлланилиши, олинган натижаларнинг амалиѐтга
қўлланилиши, натижаларнинг Республика ва дунѐ миқѐсидаги бир қатор
илмий амалий конференциялардаги тақдимоти, ренцензияланадиган
журналларда чоп этилиши, ҳамда олинган ихтирога патентлари билан
тасдиқланган.
Тадқиқот натижаларининг илмий ва амалий аҳамияти.
Тадқиқот
натижаларининг илмий аҳамияти шундаки, лагохилин ва глицирризин
кислотаси ажратиб олинган, лагохилиннинг қатор ҳосилалари синтез
қилинган, улар асосида янги супрамолекуляр комплекс бирикмалари
9
олинган. Лагохилин ҳосилаларининг гемостатик фаолликлари ўрганилган ва у
кимѐвий тузилишига боғлиқлиги аниқланган. Бирикмаларнинг тузилиши
физик-кимѐвий ва математик усуллар ѐрдамида тасдиқланган. Комплекс
бирикмаларнинг реологик хусусиятларини ўрганиш натижасида,
бирикмаларни мицелляр ҳолати водород боғлар ва гидрофоб-гидрофоб
таъсирлашишлар орқали мувофиқлашганлиги кўрсатилган. Ишнинг амалий
аҳамияти олинган супрамолекуляр комплекслар асосида самарали гемостатик
дори воситалари «Глилагин» ҳамда «Лаговин» ва уларнинг лаборатория
ҳамда саноат регламентлари, дори шакллари «Глилагин 0,005г таблеткалари»,
«Лаговин 0,15% эритмаси» учун Вақтинчалик Фармакопея мақоласи ишлаб
чиқилди, бу эса ўз навбатида гемостатик дори воситаларини саноат миқѐсида
ишлаб чиқариши имконини беради.
Тадқиқот натижаларининг жорий қилиниши
.
Ўсимликлардан
биологик фаол терпеноидларни ажратиб олиш, тузилиши ва фаолликларини
аниқлаш натижасида янги самарали гемостатиклар ишлаб чиқиш асосида:
вена қон томири ичига қўлланиладиган гемостатик «Лаговин» дори
воситаси учун Ўзбекистон Республикаси Интеллектуал мулк агентлигининг
ихтирога патенти (04.12.2013 й., №IAP 04806) олинган. Гемостатик восита
паренхиматоз қон кетишни тўхтатишда ишлатиш учун тавсия қилинган;
«Глилагин» субстанцияси асосида қон тўхтатувчи гемостатик пленка
учун Ўзбекистон Республикаси Интеллектуал мулк агентлигининг ихтирога
патенти (13.10.2015 й., №IAP 05109) олинган. Яратилган маҳаллий дори
шакли капилляр ва қон томирлардан қон кетишини тўхтатишда
фойдаланилган;
яллиғланишга қарши қўлланиладиган «Глицирам - 0,05г таблеткалари»
учун клиник синовлари ўтказилган ва «Глицирам» субстанцияси учун
Вақтинчалик Фармакопея мақоласи 42 Уз2369-2013 (18.10.2013 й.,) ишлаб
чиқилган ва тасдиқланган. Яратилган препарат республикада шу турдаги
дори воситаларининг импорт ўрнини босиш имконини беради.
Тадқиқот натижаларининг апробацияси.
Тадқиқот натижалари 7 та
Республика ва 5 та халқаро илмий-амалий анжуманларда презентация
тарзида баѐн этилган ва апробациядан ўтган, жумладан, «Биология - наука
XXI века» (Пущино, 2005); «6
th
International Symposium on the Chemistry of
Natural Compounds» (Анкара, 2005); «Современные проблемы биохимии и
эндокринологии»
(Тошкент,
2006);
«Биология,
экология
ва
тупроқшуносликнинг долзарб муаммолари» (Тошкент, 2006); «Табиий
бирикмалар кимѐси долзарб муаммолари» (Тошкент, 2009); «Проблемы
органической химии » (Москва, 2009); «Renewable Wood and Plant Resorches:
Chemistry, Technology, Phаrmacology, Medicine» (Санкт-Петербург, 2011);
«International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds» (Урумчи,
2011); «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой
хирургии» (Москва, 2013); «Биоорганик кимѐ фани ривожланиши долзарб
муаммолари» (Тошкент, 2013).
10
Тадқиқот натижаларининг эълон қилиниши.
Диссертация мавзуси
бўйича жами 40 та илмий иши чоп этилган, шулардан, Ўзбекистон
Республикаси Олий аттестация комиссиясининг докторлик диссертациялари
асосий илмий натижаларини чоп этиш тавсия этилган илмий нашрларда 11 та
мақола, жумладан, 9 таси республика ва 2 таси хорижий журналларда нашр
этилган, 2 та патент олинган ва 2 та саноат регламенти ва битта ВФМ ишлаб
чиқилган.
Диссертациянинг тузилиши ва ҳажми.
Диссертация таркиби кириш,
еттита боб, хулоса, фойдаланилган адабиѐтлар рўйхати ва иловалардан
иборат. Диссертациянинг ҳажми 182 бетни ташкил этган.
ДИССЕРТАЦИЯНИНГ АСОСИЙ МАЗМУНИ
Кириш
қисмида диссертация мавзусининг долзарблиги ва зарурийлиги
асослаб берилган, мақсад ва вазифалар, шунингдек тадқиқотнинг объект ва
предмети ифодаланган, тадқиқотнинг республика фан ва технологияларни
ривожлантириш йўналишига мувофиқлиги келтирилган, тадқиқотнинг илмий
янгилиги ва амалий натижалари баѐн қилинган, олинган натижаларнинг
ишончлилиги асосланган, натижаларнинг назарий ва амалий аҳамияти очиб
берилган, тадқиқот натижаларининг амалиѐтга жорий этиш рўйхати
келтирилган, чоп этилган ишлар ва диссертациянинг тузилиши тўғрисида
маълумотлар келтирилган.
Диссертациянинг
«Lagochilus Inebrians»
ва
«Glycyrrhiza Glabra»
тури
ўсимликлари
ди-
ва
тритерпеноидлари
тузилиши,
биологик
хусусиятлари
» деб номланган биринчи бобида,
Lagochilus
оиласига мансуб
ўсимликлар,
уларнинг
тарқалиши,
кимѐвий
таркиби
тўғрисидаги
маълумотлар келтирилган. Лагохилиннинг ҳосилалари ва уларни ажратиб
олиш усуллари, кимѐвий модификация қилиш ҳамда ширинмия ўсимлиги,
унинг илдизи кимѐвий таркиби, асосий тритерпен гликозиди - ГК ва унинг
тузлари тузилиши, трансформацияси, биологик фаоллиги ва унинг
тузларининг коллоид-кимѐвий хусусиятлари ҳамда дори моддалари билан
комплекслари тўғрисидаги маълумотлар баѐн қилинган.
Диссертациянинг
«Гемостаз системаси ва гемостатаик препаратлар»
деб номланган иккинчи бобида гемостатик препаратлар, уларнинг таъсир
механизмлари ва гемостаз жараѐниннинг бузилиш ҳолатлари тўғрисидаги
адабиѐтлар шарҳи келтирилган.
Диссертациянинг
«Материаллар, шароитлар ва тадқиқотнинг
замонавий усуллари, биологик фаоллик
» деб номланган учинчи бобида
диссертацияни бажаришда фойдаланилган материаллар, реактивлар, юпқа
қатлам хроматографияси учун ишлатилган системалар, ажратиш усуллари ва
лагохилин билан глицирризин кислотаси (унинг тузлари) ни тозалаш,
уларнинг хосилаларини олиш, ҳамда гемостатик фаолликни аниқлаш ва
миқдори таҳлил усуллари тўғрисидаги маълумотлар келтирилган.
Диссертациянинг «
Лагохилин, ГК ва унинг тузларини ажратиб
олиш, лагохилин ҳосилалари синтези»
деб номланган тўртинчи бобида,
11
сархушлантирувчи Лагохилус ўсимлигидан лагохилин дитерпеноидини
ажратиб олиш усулини такомиллаштириш ва ТГК сидан ГК ва унинг
тузларини
олиш
технологик
схемаси,
Лагохилиннинг моногидрат
кристалининг тузилиши ва унинг ароматик ацеталлари синтези келтирилган.
Сархушлантирувчи Лагохилус ўсимлигидан лагохилинни ажратиб олиш
усулини такомиллаштириш жараѐни шундан иборатки, дихлорэтандан 13-14
қайта регенерация қилмасдан фойдаланилган (оптимал 10-11 қайта) электр
энергиясининг, эритувчи миқдорининг ҳамда умумий экстракция вақтининг
тежалишига олиб келган.
Лагохилин ацетонда қайта кристалланади ва турли хил эритувчиларда
қайта криссталлаш натижасида икки хил тузилишга эга кристаллар: сувсиз ва
моногидрат шакллари ҳосил бўлади. Лагохилин кристалларининг рентген
тузилиш таҳлили натижалари профессор Ибрагимов Б.Т. бошчилигида
ўрганилган. Лагохилиннинг моногидрат тузилишдаги монокристали
ацетон:толуол:этанол
эритувчилари
аралашмасида
олинган.
Монокристаллнинг тузилиши рентген тузилиши тахлили (РТТ) усули
ѐрдамида ўрганилган.
Лагохилиннинг молекуляр халқасидаги ўринбосарлар маълум қонуният
асосида ўзгариб борадиган ароматик альдегидлар билан реакцияси шу
кунгача ўрганилмаган. Шунинг учун лагохилиннинг бир қатор ароматик
альдегидлар билан реакция шароитларини ўрганиш қизиқарли бўлган.
Лагохилиннинг ароматик ацеталлари синтези умумий схемаси қуйида
келтирилган (1-схема).
O
CH
2
OH
O
CH
2
OH CH
2
OH
CH
2
OH
+
СНО
O
HOH
2
C HO
R R 1 2
R
1
2
R
O
Бу ерда R
1
ва R
2
- ОН, -ОСН
3
, -ОС
2
Н
5
,-Вr. (II.1- II.8)
1-схема. Лагохилиинннг ароматик ацеталлари синтези умумий схемаси.
Лагохилиннинг ароматик ацеталлари синтезида ароматик халқада
ўринбосарлар сифатида турли хил алкоксил гуруҳлар бўлганда катализатор
сифатида конц. H
2
SO
4
, ароматик халқада гидроксил гуруҳи бўлганда эса,
сувсиз мис сульфатни қўллаш мақбул эканлиги кўрсатилган. Барча синтез
қилинган ароматик ацеталларни тозалашда колонкали хроматография
усулидан фойдаланилган. 1-жадвалда уларнинг айрим физик-кимѐвий
катталиклари келтирилган. Синтез қилинган моддаларнинг тузилиши ИҚ- ва
ПМР-спектрлари асосида тасдиқланган.
Лагохилин ацеталларининг ИҚ-спектрларида асосий тебраниш
частоталари 3300-3400 см
-1
соҳадаги кенг елка шаклида намоѐн бўлиб, бу
лагохилин молекуласидаги 15,16-ҳолатларидаги молекулалараро водород
боғлар ҳосил қилишда иштирок этган гидроксил гуруҳларининг валент
12
тебранишларига тегишли, фенол халқадасиги гидроксил гуруҳларнинг валент
тебранишлари 3200 см
-1
соҳада кузатилади (4-8 бирикмалар). 4-8
моддаларнинг ПМР-спектрларида 0,80-0,90 м.у. соҳадаги синглет
кўринишидаги сигналлар С
8
ва С
10
метил гуруҳларининг протонларига
тегишли. 3,4-4.0 м.у. соҳасида лагохилиннинг С
15
, С
16
и С
18
ҳолатлардаги -
ОСН
2
-гуруҳлари протонлари сигналлари бўлса, 5,5 м.у. соҳасида учламчи –
СН, гуруҳи протонлари сигналлари кузатилади.
1-жадвал
3,18-бензилиден-15,16-диокси-9,13-эпоксилабданларнинг айрим
физик-кимѐвий катталиклари
№
Ar
*R
f
Катализатор
Т
суюқ.,
о
С
Унум
%
2
OCH
3
0,73
Н
2
SO
4
(конц.)
-
55
3
H
3
CO
OCH
3
0,26
Н
2
SO
4
(конц.)
-
60
4
OH
0,50
СuSO
4
(сувсиз)
136-137
35
5
OH
HO
0,38
СuSO
4
(сувсиз)
138-139
27
6
OH
OCH
3
0,45
СuSO
4
(сувсиз)
150-151
25
7
OH
OC
2
H
5
0,41
СuSO
4
(сувсиз)
167-168
30
8
OH
Br
0,40
СuSO
4
(сувсиз)
173-174
36
*Система: метанол:ацетон (2:1)
Тадқиқотнинг навбатдаги босқичида лагохилиннинг ацетил ҳосилалари
синтези амалга оширилди. Адабиѐтлардаги маълумотларда лагохилиннинг
тетраацетил ҳосиласи синтези тўғрисида маълумотлар кўп учрайди, лекин
унинг моно-, ди- ва триацетил ҳосилалари асосан ўсимликлардан
хроматография усулида ажратиб олинганлиги тўғрисида маълумотлар
келтирилган. Шунинг учун биз лагохилинга сирка ангидриди таъсир эттириб,
унинг тетраацетил ҳосиласини синтез қилдик. Уни юмшоқ гидролизга
учратиб, колонкали хроматография усулида моно-, ди- ва триацетил
ҳосилалари ажратиб олишни амалга оширдик.
13
Биологик фаол моддаларнинг фаоллигини сувли муҳитда ўрганиш
муҳим аҳамиятга эга (инсон организмининг 60-75% ни структураланган
сувдан иборат), шунинг учун бизга ГК ва унинг тузларини ажратиб олиш
билан бир қаторда, улар асосида олинган супрамолекуляр комплекс
бирикмалар сувли эритмаларининг айрим фундаментал жиҳатлари ва физик
кимѐвий хусусиятларини ўрганиш ҳам зарур эди. Олинган натижалар ўз
навбатида самарали, юқори технологик, кенг таъсир доирасига эга бўлган
гемостатик дори воситаларни ишлаб чиқишда илмий асос бўлиб хизмат
қилади.
Турли хил тузилишга эга бўлган биологик фаол бирикмаларнинг
таъсирини кучайтириш мақсадида, уларни кимѐвий усуллардан: жумладан
тузларини олиш (агарда бу уларнинг асосий биологик фаоллигига таъсир
кўрсатмаса), ковалент ва ноковалент боғлар ҳосил қилувчи моддалар билан
модификация қилиш, тиббиѐтда ишлатишга рухсат этилган полимер
моддалардан транспорт агенти сифатида фойдаланиш; турли хил
қуйимолекуляр ташувчи моддалар (лиганд) сифатида циклодекстринлар,
краун эфирларидан ва охирги ўн йил ичида амфифил табиатли табиий
бирикмалардан, хусусан ГК ва унинг тузларидан кенг фойдаланилмокда.
Маълум бўлган дори воситалари (ностероид яллиғланишга қарши воситалар,
простагландинлар, урациллар) асосида янги дори воситаларини олишда
ташувчи (транспортировка килувчи)
сифатида 18 таклиф қилинган.
β
-глицирризин кислотаси
Бунга асос сифатида эса комплекс ҳосил қилувчи ГК таркибида
гидрофил (дори воситасини боғловчи қисм) ва гидрофоб (транспортировкага
жавоб берувчи қисм) қисмларининг мавжудлиги бўлган. Бизнинг асосий
объектимиз лагохилин ва унинг изопропилиден, ацетил ва бензилиден
ҳосилалари сувда ѐмон эрийди. Уларнинг сувда эрийдиган комплексларини
олиш учун солюбилизация қилувчи агент сифатида ГК ва унинг моно
(аммонийли, калийли, литийли) тузларидан фойдаланишга харакат қилинган.
Юқоридагиларни инобатга олган ҳолда, ушбу бобда, ГК ни ажратиб
олиш усуллари, тозалаш технологияси, унинг тузларини олиш шароитларини
излаш ва лагохилин билан супрамолекуляр комплекс бирикмаларни олиш
усуллари тўғрисида тўхталамиз. ГК ни ширинмия илдизидан ажратиб олишга
бир қатор илмий ишлар бағишланган. Уларнинг барчасини асоси технологик
жараѐн бошланғич босқичида сифатли, бирламчи экстракт олиш ва охирги
маҳсулотни зарур кондициягача қуюлтиришдан иборат.
Бошланғич техник маҳсулотни экстрактни қуюлтирмасдан сульфат
кислота таъсир эттириб олиш усули апробация қилинди (2-схема). Олинган
техник маҳсулот таркибида ГК нинг миқдори 25 % дан 45 % ташкил қилиб,
техник ГК (ТГК)ни 9-11% унум билан олинган.
14
Ширинмия илдизини майдалаш
Аммиак билан ишлов бериш
Экстракция килиш
филтрлаш
Экстракт
Н + чўктириш
Кайта экстракция
килиш
филтрлаш - куритиш - кадоклаш
2- схема. Ширинмия илдизидан ТГК ажаратиб олиш технологик
жараѐни
2-жадвалда ТГК нинг баъзи физик-кимѐвий характеристикалари келтирилган.
2-жадвал
Техник ГК нинг айрим физик-кимѐвий характеристикалари
№
Кўрсаткичлар номлари
Таҳлил маълумотлари
1
Ташқи қўриниши
Аморф - қаттиқ донадор кукун
2
Таъми
Ёқимли ширин таъмли
3
ГК миқдори, %
40,0±5,0%
4
Намлилик даражаси, %
5,5±1,5
5
Умумий кул миқдори, %
11,4±0,7
ТГК учун «АгроБиоКимѐ» МЧЖ билан ҳамкорликда «ТSh 19783536-
02:2013» ишлаб чиқилган. Ишлаб чиқилган технология асосида ширинмия
илдизини қайта ишлашга мўлжалланган Қорақалпоғистон Республикаси
Беруний туманида жойлашган «Баходир ва К» ХКда 1,5 тонна миқдорида
ТГК олинди.
Олинган ТГК асосида ГК ва унинг тузлари олинган. Мазкур технологик
жарѐн ГК ни ацетонга экстракция қилиб олиш ва уни учалмашинган тузи
кўринишида чўктириш, кислотали гидролиз қилиш орқали 72-75%
тозаликдаги моноалмашинган тузларини олишга асосланган.
15
1. ацетон
2. 10% КОН метанол
Техник Глицирризин кислотаси
1. ацетон
2. 10% LiОН метанол
1. ацетон
2. 25% аммиак
ГК уч калийли тузи
Муз сирка кислотаси
ГК уч литийли тузи ГК уч аммонийли тузи
Муз сирка кислотаси
ГК 72-75% моно калийли тузи ГК 72-75% моно литийли тузи ГК 72-75%
моно аммонийли тузи 80% этанолдан кайта кристаллаш
ГК 80-82% моно калийли тузи
ГК 80-82% моно аммонийли тузи
80% этанолдан кайта кристаллаш
ГК 80-82% монолитийли тузи
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
Глицирризин кислотаси
3-схема. ГК ни ширинмия илдизидан ажратиб олиш технологик
жараѐни
16
Олинган ГК ва унинг тузлари бир қатор физик-кимѐвий ва спектрал
кўрсаткичлар билан характерланди.
3-жадвалда уларнинг баъзи физик-кимѐвий катталиклари келтирилган.
3-жадвал
ГК ва унинг тузларни баъзи физик-кимѐвий катталиклари
№
Моддалар
Ташқи
кўриниши
М.оғ.
Т.қай.
о
С
R
f
/α /
D
0,5%
ИҚ
см
-1
УБ
нм
32
Глициризин
кислотаси (ГК)
оқ рангли
кукун 840
210-21
3
0,07(I
I)*
0,14(
V)
+48
1042, 1656,
2873, 2948,
251
33 ГКМАТ +3Н
2
О
сариқ
рангли
кукун 894
225-22
7
0,32
(VII)
0,06 (I)
+40
1042, 1655,
2948, 3239,
251
34
ГКМКТ
оқ ѐки оч
сариқ рангли
кукун 878
280-28
4
0,30
(VII)0.2
6(II)
0.12(VI)
+36
1043, 1657
2948,3404
254
35
ГКМЛТ
оқ рангли
кукун 846
250-25
3
0,30
(VII)0.2
6(II)
+36
1037, 1664
2941, 3410
251
*Система:I
-
этанол:хлороформ (1:3), II
-
метанол:хлороформ (1:3), III
сув:ацетонитрил:ацетон
(3:4:2), IV
-
этанол:хлороформ (1,5:3), V
-
метанол:ацетон (2:1), VI
-
сув:
ацетонитрил:ацетон (1:1:1).
ГК ва унинг тузларининг тозалик даражасини ЮССХ усули ѐрдамида
изократика усулида, диод-матрицали ва УБ детекторлар ѐрдамида аниқланди.
Бунинг учун модда маълум миқдоргача суюлтирилади ва яхшилаб
аралаштирилиб 10 минг/мин. айланиш тезлигида центрифуга қилинади ѐки
0,22 мкм миллипорали фильтр орқали фильтрланади. Ҳаракатланувчи суюқ
фаза: 35 хажм ацетонитрил, 0,5 ҳажм муз сирка кислотаси ва 64,5 ҳажм
бидистилланган сув. Оқим тезлиги 0,75-1,0 мл/минут қилиб белгиланади ва
детекция қилиш 254 нм тўлқин узунлигида 16-17 мин давомида таҳлил
қилинади.
1-расм. 80-85% тозаликдаги ГКМАТ нинг хроматограммаси
17
Хроматограммадан кўриниб турибдики, ГКМАТ га тегишли асосий чўққидан
ташқари
бир неча қўшимча кичик чўққилар мавжуд.
1
Н-ЯМР
спектроскопияси таҳлили натижаларига кўра ѐнаки моддалар: 18Н
α
-
глицирризин кислотаси ва қисман гидролизга учраган глицирризин
кислотасининг қолдиқлари, глициррет кислотасидан иборат. Уларнинг
умумий миқдори чўққилар ҳажмининг 17
±
2,5% ни ташкил қилади. ГК ва
унинг тузларини кейинги тозалаш босқичлари кислотали гидролиз қилиш,
ацетонли эритмага ўтказиш, уч алмашган тузини олиш ва кислотали гидролиз
қилишдан иборат Қайта кристаллаш натижасида тозалик даражаси 90-92% ни
ташкил қилган маҳсулот олинади. ГК ѐнаки моддалардан жуда қийинчилик
билан тозаланади. Шунинг учун 100% тозаликдаги ГК ни фақат препаратив
колонкали хроматография усули асосида ажратиб олиш мумкин. 2-расмда
100% тозаликдаги ГК нинг хроматограммаси келтирилган.
2-расм. 100% тозаликдаги ГКМАТ нинг хроматограммаси
Турли хил тозаликдаги 70-75%, 80-82%, 90-92% и 100% ГК ва унинг
моноаммонийли тузларининг биологик фаолликлари бир-биридан катта фарқ
қилмасликлари кўрсатилган. Тозалаш жараѐнларида йўқотиш миқдори катта
бўлишини ҳисобга олган ҳолда, кейинги изланишларимиз учун 80-82%
тозаликдаги ГК ва унинг тузларидан фойдаланишга қарор қилдик.
Диссертациянинг
«Супрамолекуляр комплекслар, физик-кимѐвий ва
реологик хусусиятлари»
деб номланган бешинчи бобида тажрибада олинган
маълумотлар, тузилишларнинг спектрал тасдиқланиши, физик кимѐвий
катталиклар ва ГК ва унинг тузларининг лагохилин билан комплексларининг
реологик хусусиятлари келтирилган.
4-схемада комплекс бирикмаларни олишнинг умумий схемаси
келтирилган. Барча олинган комплекслар оптик фаол бўлиб, қутбланган
ѐруғлик нури тексилигини ўнга бурувчи ҳисобланади ва комплексларнинг
унунми 84% дан 93% гача ташкил қилади (4-жадвал), суюқланиш
ҳароратлари
парчаланиш
билан
кузатилган.
Комплексларнинг УБ
спектрларида сув:спирт (50:50) системасида 251-254 нм тўлқин узунлигида
ГК молекуласи агликон қисми С ҳалқасининг қўшбоғининг р-р
*
ўтишига мос
келадиган ютилиш максимуми кузатилади.
18
CH
2
OH
O
OH
COOH
H
H
O
O
C
O
OH
O
COOH
O
CH
2
OH
H
O
C
O
O
O
O
RO
HO
OH
HO HO
+n
RO
HO
C
OH
O
HO HO
O
H
O
C
OH
O
O
O
HO
OH
O
OH
HO
OH
n
Бу ерда R: H (5-7), NH
4
(8-10), K (11-13)
4-схема. ГК ва унинг тузлари билан лагохилининг супрамолекуляр
комплексларини олишнинг умумий схемаси
Олинган комплекс бирикмаларнинг ИҚ-спектрида ГК ва унинг
тузларидаги карбонил гуруҳларга тегишли валент тебранишлар 1670-1650см
-1
соҳада кузатилса, комплексларда бу 60-55см
-1
юқори частотали соҳага
силжиши кузатилади. Бу ГКнинг ва унинг тузларининг лагохилин билан
супрамолекуляр комплекслар ҳосил бўлишидаги иштирокини кўрсатади. 3430-
3380 см
-1
соҳада гидроксил гуруҳларнинг валент тебранишлари кенг шаклда
намоѐн бўлиши лагохилин ва ГК гидроксилларининг комплекс ҳосил қилишда
иштирок қилишини кўрсатади.
4-жадвал
ГК ва унинг моноаммонийли, монокалийли тузлари билан лагохилиннинг
супрамолекуляр комплексларининг айрим физик-кимѐвий курсаткичлари
№
Комплеклар
Ташқи
кўриниши
Мол.массаси
Т.
суюқ
о
С
*R
f
/
α
/
D
0,5%
(
сув)
ИҚ,
см
-1
УБ,
нм
Унум
%
36
Л:ГК
1:2
Оқ кукун
2036
173-17
5
0.74(
V)
+12
1044, 1082
1728, 2942
251
93,8
37
Л:ГК
1:4
Оқ кукун
3716
175-17
8
0.73(
V)
+16
1044, 1080
1730, 2945
251
92,5
38
Л-ГК
1:9
Оқ кукун
7916
180-18
3
0.73(
V)
+14
1044, 1081
1732, 2947
251
93,7
39
Л:ГКМАТ
1:2
Оч сариқ
кукун, 2144
197-20
0
0.72(
V)
+24
1042, 1660
2943, 3384
250
90,0
40
Л: ГКМАТ
1:4
Оч сариқ
кукун, 3932
202-20
4
0.72(
V)
+20
1042, 1662
2945, 3385
250
84,7
41
Л- ГКМАТ
1:9
Оч сариқ
кукун, 8402
205-20
7
0.71(
V)
+22
1042, 1663
2946, 3386
250
88,7
42
Л- ГКМКТ
1:2
Оч сариқ
кукун, 2112
215-51
7
0,18
(I)
0,1(I
I)
+24
1043, 1079
1655, 3410,
251
93,2
43
Л- ГКМКТ
1:4
Оч сариқ
кукун, 3868
220-22
2
0.17
(I)
0.1(
II)
+12
1079, 1658,
2945, 3417
251
94,1
44
Л- ГКМКТ
1:9
Оч сариқ
кукун, 8258
225-22
7
0.17
(I)
0.1(
II)
+16
1043, 1660,
1948,3430,
251
93,5
*Система: I
-
этанол : хлороформ (1:3), II
-
метанол:хлороформ (1:3), V
-
метанол:ацетон (2:1),
ГК:Л (2:1) комплексининг ПМР-спектрида (ацетон: D
2
O) қуйидаги
резонанс частоталар кузатилади: 0,5 м.у. да C
17
даги C-CН
3
гуруҳнинг
19
протонлари триплет кўринишидаги сигналлари, 0,7-0,8 м.у. соҳада дублет
сигналлар лагохилин молекуласидаги С
4
ва С
10
нинг СН-СН
3
гуруҳлари
протонларига тегишли ва 1,0 м.у. да ГК нинг С
4
даги СН-СН
3
гуруҳи
протонларининг ҳамда 1,3 м.у. да синглет кўринишидаги сигналлар
лагохилинннинг С
20
нинг С-СН
3
гуруҳидаги протонларига тегишлидир.
Лагохилин молекуласидаги қолган барча протонлар 1.0-2.0 м.у. да мураккаб
сигналлар кўринишида намоѐн бўлади. 2,8-3,0 м.у. да ацетон метил
гуруҳларининг протонлари сигналлари намоѐн бўлади. 3,0-4,5 м.у. соҳада
лагохилин ва глицирризин кислотаси молекулаларидаги -СН
2
О, - СНО
гуруҳларининг протонларининг сигналлари мураккаб кўринишдаги намоѐн
бўлади. 5,0–4,5 м.у. да синглет кўринишидаги сигналлар С
12
даги олефин
протонларга тегишлидир.
Бугунги кунгда, ГК нинг гел ҳосил қилиши ва солюбилизациялаш
хусусияти кам ўрганилган бўлиб, адабиѐтларда кам ѐритилган. Шунинг учун
қуйи молекуляр табиий бирикмаларнинг физик-кимѐвий хусусиятларини,
турли хил гидрогеллари хоссаларини, шу жумладан ГК ва унинг тузлари
лагохилин билан ҳосил қилган супрамолекуляр комплексларнинг юқори
биологик фаоллик намоѐн қилиш сабабларини
ўрганиш муҳим ҳисобланади.
Диссертациянинг ушбу бўлими Ўзбекистон Миллий университети
кимѐ факультети «Полимерлар кимѐси» кафедраси олимлари (профессорлар
У.Н. Мусаев ва М.Г. Мухамедиев) билан ҳамкорликда
бажарилган.
Эритманинг структураланиш жараѐнини уларнинг қовушқоқлиги ўрганиш
орқали ҳам характерлаш мумкин. Агар эритмада эритувчи билан эриган
моддаларнинг ассоциацияси рўй берса, эритманинг қовушқоқлиги кескин
ортади. Шунинг учун супрамолекуляр комплексларнинг ассоциаланиш
даражасини аниқлаш мақсадида уларнинг сувли эритмаларини қовушқоқлиги
ўрганилган.
η
уд
/С
5
η
уд
/С
9
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5 1
0,5 0
8
1
7
6
5
3
4
3
2
2
1
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1
2
3
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
а
С,%
б
С,%
3-расм. T=298
о
K(1), T=303
о
K(2), T=308
о
K(3) ҳароратларда ГК билан
лагохилиннинг 2:1 (а) ва 9:1 (б) нисбатдаги комплекслари сувли
эритмаларининг нисбий қовушқоқлигини концентрацияга
боғлиқлиги
4-расмдан кўриниб турибдики ГК билан лагохилиннинг 2:1 нисбатдаги
комплекслари сувли эритмаси ассоциацияланган системага хос
20
бўлган жуда юқори, қовушқоқлик намоѐн қилган. Ушбу система учун
ҳароратнинг ортиши қовушқоқликнинг камайишига олиб келади. Бу ўз
навбатида ассоциатларнинг бузилишни кўрсатади. Аммо ГК билан
лагохилининг (9:1) комплекси сувли эритмаси хароратининг оширилиши
қовушқоқликнинг ҳам ошишига олиб келади. Бундан кўриниб турибдики,
комплекслар таркибининг ўзгаришига қараб гидрофиль-гидрофоб таъсирлар
ҳам турлича бўлади. ГК ва ГКМАТ билан лагохилиннинг супрамолекуляр
комлекс бирикмалари сувли эритмаларининг қовушқоқликларини ўрганиш
комплекс таркибига гидрофил хусусиятга эга моддаларни киритиш
қовушқоқликнинг камайишига олиб келса, гидрофоб хусусиятга эга
модданинг
(лагохилин)
киритилиши,
қовушқоқликнинг
ГКМАТ
ковушқоқлигига нисбатан ортишини кўрсатди. Олинган натижалар
лагохилиннинг
супрамолекуляр
комплекс
бирикмаларини
мувофиқлаштиришда асосий ўринни водород боғлар ҳамда гидрофоб
гидрофоб таъсирлашиш эгаллашини кўрсатади. Ушбу натижани тасдиқлаш
мақсадида математик моделлаш усули асосида «HyperChem» ва «Chem Draw»
дастурлари ѐрдамида «абсолют муҳит» шароитида лагохилиннинг ГК билан
ҳосил қилган супрамолекуляр комлекслари ҳосил бўлиш энергияси
ҳисобланган (4-расм).
Олинган натижалар лагохилиннинг 15 ва 18 ҳолатлардаги гидроксил
гуруҳлари билан ГК орасидаги ҳосил бўлган водород боғлар энергияси
нисбатан кичик бўлиши кўрсатилган. Шарсимон тузилишли моделда
лагохилин молекуласи ГК молекуласи ҳосил қилган халқанинг ичида эмас,
балки ташқарисида жойлашганлиги кўриниб турибди.
4-расм. Глилагиннинг молекуласининг ҳалкасимон кўриши (энергияси
787 kcal/mol)
Супрамолекуляр комплекс бирикмаларнинг сувли эритмалари реологик
хусусиятларини ўрганиш натижасида, ГК молекулалари ҳосил қилган
мицеллалар ичига гидрофоб органик молекуланинг кириши
21
мицелллалар ҳосил бўлишини кучайтириши, гидрофил молекуланинг
киритилиши эса қийинлашишига олиб келиши кўрсатилган. Шунинг учун
меҳмон молекула ГК ва унинг тузлари ҳосил қилган мицеляр қатламлар
оралиғида жойлашиши эҳтимоллиги юқори бўлиши мумкин (5-расм).
Математик ҳисоблашлар натижасида ҳақиқатдан ҳам, икки қаватли мицеляр
кўринишдаги супрамолекуляр комплекс бирикма турғунлиги ва ҳосил бўлиш
энергияси жиҳатидан, халқасимон тузилишидан афзал эканлигини кўрсатган.
5-расм. Глилагин молекуласининг мицелляр ҳолати
( ҳосил бўлиш энергияси 304.4334 kcal/mol)
.
Икки қатламли мицеляр ҳолатнинг ҳосил бўлиш энергияси халқасимон
ҳолатга нисбатан икки баробар кам. Шундай қилиб лагохилиннинг ГК билан
супрамолекуляр комплекслари модел ҳолатини квант-кимѐвий ҳисоблашлар
натижасида, халқасимон шаклдаги комплекс
бирикманинг тузилиши
энергетик жиҳатдан мумкин эмаслигини (қулай бўлмаган) кўрсатилган.
Лагохилиннинг иккита молекула ГК билан комплекс ҳосил қилиш жараѐни,
бу тули хил (сферасимон, икки қаватли, эллипсоид) кўринишдаги мицеллалар
ҳосил бўлишида оралиқ ҳолат деб ҳисоблаймиз.
Мицелла ҳосил қилиш критик концентрациясини (МҲКК) аниқлашда
ГКМАТ нинг гидрофоб хусусиятга эга лагохилин билан олинган
комплексининг МҲКК си ГКМАТ никига нисбатан паст эканлиги
кўрсатилган. Бундан лагохилиннинг молекуляр комплекс ичига киритилиши
ГКМАТ структураланиш жараѐнига мувофиқлаштирувчи сифатида таъсир
қилишини кўрсатади.
Диссертациянинг «
Супрамолекуляр комплексларнинг гемостатик
фаоллигини аниқлаш
» деб номланган олтинчи бобида ГК, ГКМАТ ва N
поливинилпирролидон билан лагохилиннинг комплексларининг, лагохилин
ҳосилаларининг гемостатик фаоллиги, in vitro тажрибаларида Лаговин
препаратининг қон қуюлиш жараѐнига таъсири ва унинг захарлилик
хусусиятлари тўғрисида маълумотлар келтирилган.
22
Барча бирикмаларнинг гемостатик фаолликлари ЎзР ФА БКИ
Фармакология лабораториясида б.ф.н. Н.Л. Выпова бошчилигида бажарилган.
Синтез қилинган бирикмаларни кимѐвий тузилишига қараб 3та гуруҳга
ажратиш мумкин: I. лагохилин ва унинг изопропилиден, ацетил ҳосилалари
(1, 10-24); II. ангидролагохилинлар (28-30); III. дитерпеноид лактонлар (9,
25-27)
ҳамда Лагоден препарати (31). Қиѐслаш учун Лагоден препаратининг
гемостатик фаоллиги 100% деб қабул қилинган (5-жадвал).
1
20
9
OCH
2
OR
4 15
O O
O O
OCH
2
OH
COONa
R
1
O
3 5
17
CH
2
OR
3
R
1
O
O
R
1
O
R
1
O
R
19
2
O
18
R
2
O
R
2
O
R
2
O
1,10-24 9, 25-27 28- 30 31 а
C
CH
3
CH
3
б
H
3
C CO
5-жадвал
Лагохилин ва унинг ҳосилаларининг гемостатик фаоллиги
№
Ўринбосарлар
Гемостатик фаоллик
R
1
R
2
R
3
R
4
%
сек
II.1
H
H
H
H
67
130,0±12,6
II.10
а
Н
Н
40
157,0±14,8
II.11
а
а
0
268,1±19,8
II.12
а
б
б
33
163,7±13,5
II.13
а
б
Н
32
165,0±14,7
II.14
б
Н
Н
Н
83
115,0±11,4
II.15
Н
Н
Н
б
82
116,0±10,8
II.16
Н
Н
б
б
83
115,0±10,5
II.17
б
б
Н
Н
84
114,0±10,6
II.18
б
Н
Н
б
83
115,0±10,6
II.19
б
Н
б
Н
83
115,0±11,0
II.20
Н
б
б
Н
83
115,0±11,0
II.21
Н
б
б
б
81
117,0±10,6
II.22
б
б
Н
б
83
115,0±11,2
II.23
б
б
б
Н
81
117,0±10,5
II.24
б
б
б
б
17
211,0±16,0
II.9
Н
Н
-
-
60
148,0±13,5
II.25
а
а
-
51
179,0±16, 5
II.26
Н
Н
-
-
68
129,0±13,0
II.27
б
Н
-
-
67
130,0±13,0
II.28
Н
б
-
-
57
141,0±13,7
II.29
б
б
-
-
66
131,0±12.6
II.30
а
-
-
33
140,0±13,0
II.31
назорат
100
98,0±10,0
*Р
<
0,01 назоратга нисбатан
23
Лагохилиннинг барча ҳосилалари қайсидир миқдорда гемостатик
фаолликка эга. 5-жадвалдаги келтирилган катталиклардан, шуни кўриш
мумкинки, лагохилиннинг шафтоли ѐғидаги 0,5% ли эритмаси 67% фаоллик
намоѐн этса, унинг С
3
ва С
18
ҳолатлардаги гидроксил гуруҳларини
изопропилидан гуруҳи билан ѐпилиши гемостатик фаолликнинг 40%
тушишига олиб келса, кейинги С
15
ва С
16
гидроксилларнинг ҳам тўла
изопропилиден ҳисобига ѐпилиши эса фаолликнинг йўқолишига олиб келган.
Ангидролагохилин нисбатан суст гемостатик фаоллик (57%) намоѐн
қилса, С
3
ва С
18
ҳолатларини изопропилиденга алмаштирилиши гемостатик
фаолликнинг 33% (II.38) камайишига олиб келган. Лагохирзиннинг С
3
ва С
18
ҳолатларини ацетил гуруҳларига алмаштириш гемостатик фаоликка
сезиларли таъсир кўрсатмаган 67% (II.26 II.27). Лагохирзинга изопропилиден
гуруҳининг киритилиши гемостатик фаолликнинг 51% (II.25) гача
пасайишига олиб келса, лактон халқанинг очилиши, яъни 3,16,18-
тригидрокси-9,13-эпоксилабдан-15-кислотасининг натрийли тузи ҳосил
бўлишига, унинг гемостатик фаоллигининг кескин ортишига олиб келади
(100%, II.31).
Лагохилин (II.1), ангидролагохилин (II.28) ва лагохирзин (II.9)
қаторидаги
бирикмаларининг
гемостатик
фаоллигини
солиштириш
натижасида энг фаол модда лагохилин 67%, лагохирзин 60% ва
ангидролагохилин 57% эканлиги кўрсатилган.
Шундай қилиб лагохилиннинг иккита ѐки учта гидроксилларининг
ацетил гуруҳларига алмашиниши гемостатик фаолликка нисбатан сезиларли
таъсир кўрсатмаса ҳам, тўртта гидроксил гуруҳларининг тўла алмашиниши
гемостатик фаолликнинг нисбатан пасайишига олиб келади. Молекулага
изопропилиден гуруҳининг киритилиши эса гемостатик фаолликка салбий
таъсир кўрсатади, бу ўз навбатида молекуланинг гидрофоблигининг ошиши
билан боғлиқ бўлиши мумкин.
Лагохилиннинг ГК ва унинг тузлари билан турли хил нисбатлардаги олинган
супрамолекуляр комплексларининг энг оптимал нисбатини аниқлаш
мақсадида уларнинг специфик гемостатик фаоллиги ўрганилган (6-жадвал).
6-жадвал
Супрамолекуляр комплекслар сичқонларга юборилгадан сўнг 60 минут
ўтгач қон тўхтатиш вақтлари (M
±
m; n=5)
№
Препарат номи
Қон тўхташ вақти
сек.
%
Р
1
Назорат, мг/кг
360
±
20
100
-
32
ГК:Л; 2:1, мг/кг
160
±
13
45
<
0,01
33
ГКМАТ: Л; 2:1,
мг/кг
85
±
61
24
<
0,01
34
ГК:Л; 4:1, мг/кг
165
±
14
46
<
0,01
35
ГКМАТ:Л; 4:1, мг/кг
100
±
10
28
<
0,01
36
ГК:Л; 9:1, мг/кг
185
±
16
51
<
0,01
37
ГКМАТ:Л; 9:1, мг/кг
120
±
12
33
<
0,01
24
Олинган натижалардан олинган комплекслар бирикмалар табиати ва
нисбатидан келиб чиққан ҳолда қон кетиш вақтини 2-4 марта қисқартириши
аниқланган. Лагохилин (Л) билан ГКМАТ асосида олинган супрамолекуляр
комплекслар юқори фаолликка эга эканлиги аниқланган. Маҳаллий қон
тўхтатувчи дори воситасини яратиш учун, комплекслар ичида энг фаол
бўлган нисбат (ГКМАТ:Л, 2:1), шартли равишда «Глилагин» деб номланди ва
чуқур фармако-токсикологик изланишлар учун тавсия қилинди. «Глилагин»
субстанцияси учун ВФМ ишлаб чиқилди ва зарур бўлган клиник олди
фармако-токсикологик ва гемостатик фаоллигини аниқлаш учун махсус
тажрибалар олиб борилган.
«Глилагин» субстанцияси бўйича олинган натижалар асосида унинг
таблетка дори шакли таркиби (Глилагин таблеткалари -0,005г, перорал)
ишлаб чиқилди.Вақтинчалик Фармакопея Мақоласи (ВФМ) лойиҳасини
ишлаб чиқиш учун зарур бўлган стандарт тажрибалар ўтказилган.
Кўпчилик ҳолатларда паренхиматоз қон кетишининг олдини олиш учун
перорал қўлланиладиган дори шакллари, қон тўхтатиш вақт оралиғи катта
бўлганлиги сабабли зарур гемостатик самарани бермаган. Шунинг учун,
одатда ушбу ҳолатларда вена қон томири орқали қўлланиладиган препаратлар
ишлатилган. Республикамизда вена қон томири ичига қўлланиладиган
самарали қон тўхтатиш хусусиятига эга бўлган Лагоден (Лагохилин ҳосиласи)
дори воситаси ишлаб чиқилган. Аммо, унинг синтез қилиш жараѐни кўп
миқдорда энергия талаб қилиши, қиммат эритувчилар ва катализаторлар
қўлланилиши, унуми камбўлган (бошланғичдан 10-12%)
ҳамда беш босқичдан иборат. Шунинг учун лагохилин асосида нисбатан
арзон, сувда эрувчан, самарали қон тўхтатувчи восита яратиш долзарб
ҳислобланган. Субстанцияни олиш технологик жараѐни содда, ѐнғиндан
хавфсиз ва арзон бўлиши назарда тутилган.
Маълумки, тиббиѐт амалиѐтида қўлланиладиган полимер боғловчилар
асосан дори воситасининг эрувчанлиги оширувчи сифатида ишлатилади.
Шундай полимерлардан бири N-поливинилпирролидон (ПВП) ҳисобланади.
Қуйимолекуляр ПВП эритмаси тиббиѐтда детоксикант сифатида қўлланилади
ва инсон танасидан 2-3 кунда тўлиқ чиқиб кетади. Комплекс олиш учун
молекуляр массаси 8000
±
2000 Д тенг бўлган ПВП дан фойдаланилди. ПВП
билан лагохилиннинг комплекси қуйидаги 5-схема
бўйича олинган.
сн сн
2
n
O
сн
2
он
сн сн
2
n
O
сн
2
он
H
сн
2
он
N O
+
HO
сн
2
он
N O
O
H O X
HO
Y
5-схема. ПВП билан лагохилин комплексларини олишнинг умумий
схемаси
Лагохилин (Л) билан N-поливинилпирролидоннинг 1:5, 1:10, 1:15 ва
1:20 нисбатлардаги супрамолекуляр комплекс бирикмалари олинган.
25
Улар орасида 1:15 нисбатдаги комплекс барқарорлиги ва гемостатик
фаоллиги бўйича энг самарали эканлиги аниқланди (7 жадвал). Янги
супрамолекуляр комплекс шартли равишда «Лаговин» («Лаго»-лагохилин
сўзидан, «вин»-винилпирролидон сўзидан) деб номланди ва ўзида бошланғич
компонентларнинг ижобий хусусиятларини сақлаган ҳолда, комплекс
терапевтик таъсирга эга, гемостатик фаоллиги жиҳатдан «Лагоден» ва
«Дицинон»дан қолишмайди. Уларнинг айрим физик-кимѐвий константалари
7-жадвалда келтирилган.
7-жадвал
ПВП билан лагохилин комплексларининг айрим физик-кимѐвий
катталиклари
№ Комплекс
Т
суюқ.,
0
С
Эрувчанлик %
(сув)
ИҚ, см
-1
Унум %
38
ПВП:Л
5:1
95-96
100
турғун эмас
1666 С=О, 2960
C-N 3436-3422
-OH
95-97
39
ПВП:Л
10:1
96-97
100
турғун эмас
1661 С=О, 2951
C-N 3431-3426
-OH
94-96
40
ПВП:Л
15:1
98-100
100
1662 С=О, 2955
C-N 3435-3420
-OH
92-95
41
ПВП:Л
20:1
99-100
100
1667 С=О, 2958
C-N 3433-3428
-OH
91-94
Лаговинни олиш усули технологик жиҳатдан содда, охирги махсулот
унуми эса 90% дан ошиқни ташкил қилади. Лаговиннинг фармако
токсикологик изланишлари ЎзР ФА Биоорганик кимѐ институти
фармакология лабораториясида ва биокимѐвий тажрибалар ЎзМУ биология
факультети, биокимѐ кафедрасида б.ф.д., профессор С.Н.Долимова
бошчилигида амалга оширилган. Лаговиннинг қон қуюлиш жараѐнини
мувофиқлаштириш хусусияти
in vitro
тажрибаларида турли хил
концентрацияларда ўрганилган (8-жадвал).
8- жадвал
Лаговин препаратини тоза қон ва плазмага қон қуюлиш вақтига
таъсири (М
±
m; n= 6)
Препарат
Концен
трация,
%
Қон қуюлиш вақти, сек.
1мл қон
+0,1мл препарат
0,1мл плазма + 0,1мл
СаСI
2
+ 0,1мл
препарат
0,2мл плазма
+ 0,2мл препарат
Физ.
эритма
0,9
150
±
10,0
110,0
±
6,5
қуюлмади
СаСI
2
0,0277
-
-
78,0
±
6.6
Лаговин
0,1
100,0
±
10,0*
78,0
±
6,5*
қуюлмади
Лаговин
0,5
75,0
±
5,0*
60,0
±
4,0*
65,0
±
5,0
Лаговин
1,0
165,0
±
16,0
75,0
±
5,0*
96,0
±
8,0
*Р
<
0,01 назоратга нисбатан
26
Келтирилган маълумотларга асосан Лаговин оптимал (0.5%)
концентрацияда қон қуюлиш жараѐнининг I ва II фазаларини
фаоллаштиради.
Диссертациянинг
«
Гемостатик
дори
препаратларини
ва
субстанцияларни стандартлаш
» деб номланган еттинчи бобида янги дори
воситаларини яратиш ва субстанция ва дори шаклларини стандартлаш,
бўйича олинган натижалар келтирилган. «Глилагин» дори воситасини
стандартлаш
жараѐнида
Лагохилин
дитерпеноидининг
ўзига
хос
хусусиятлари ҳисобга олинган. Лагохилинда тўртта гидроксил гуруҳи
бўлишига қарамасдан, унинг молекуласида яққол намоѐн бўлган хромофор
гуруҳлари йўқ, шунинг учун уни оддий спектроскопия усуллари орқали
аниқлаш имконияти чекланган. Шунинг учун ЎзР ФА ЎМКИ ходимлари
билан биргаликда лагохилинни субстанция таркибидаги миқдорини
аниқлашнинг ПМР спектроскопияси усули ишлаб чиқилди.
Назарий жиҳатдан унинг миқдори 17,18% ташкил қилади. ПМР
усулига асосан «Глилагин» препаратида лагохилиннинг миқдори 17,5
±
1,13%
ташкил қилиши аниқланган, бу эса назарий қийматига мос келади. Лекин
ушбу усул ҳозирги кунда фармакопея усуллари қаторига кирмаганлиги
сабабли, миқдорий анализ учун биологик усул таклиф қилинди. Препарат
терапевтик дозада назоратга нисбатан 4-5 марта тез ҳамда 60-100 секунд
оралиқда қон кетишини тўхтатиши кўрсатилган.
«Глилагин» субстанциясини олишнинг технологик схемаси ишлаб
чиқилган. Таклиф қилинган семага асосан охирги маҳсулотнинг унуми
назарийга нисбатан 93-97% ташкил қилган.
Охирги маҳсулотнинг мухим кўрсаткичлардан бири - бу технология
жараѐнида фойдаланилган органик эритувчиларнинг қолдиқ миқдорини
аниқлаш ҳисобланади. Таҳлил ГХ Perkin Elmer фирмаси Clarus-400 (АҚШ)
амалга оширилди (6-расм). Таҳлил натижаларига кўра «Глилагин»
субстанцияси қолдиқ органик эритувчиларни сақламаслиги аниқланди.
6-расм. Глилагиннинг субстанцияси хроматограммаси
Субстанция бўйича олиб борилган фармако-токсикологик изланишлар
якунига асосан, Тошкент фармацевтика институти доценти А.М.Усуббаев
27
билан ҳамкорликда «Глилагин-0.005г таблеткалари» дори шакли ишлаб
чиқилди. Таблетканинг таркиби (таблетка массаси-0.1г) субстанция- 0,005 г;
микрокристаллик целлюлоза - 0,082 г; картошка крахмали - 0,012 г; кальций
стеарат - 0,001 г.
Глилагин таблеткаларини («Tash Farm A.I.» МЧЖ билан ҳамкорликда)
олиш саноат регламенти ишлаб чиқилди ва тасдиқланди. Субстанция ва дори
шакллари учун ВФМ лойиҳалари ишлаб чиқилди, клиник олди фармако
токсикологик изланишлари олиб борилди ва ЎзР ССВ Дори воситалари ва
тиббиий техника сифатини назорат қилиш Бош бошқармаси томонидан
(«ГЛИГ №84/6.П/62.Уз.2012/381» қарори) ЎзР ССВ қарашли қуйидаги
даволаш муассасаларига йўналтирилди.
1. Гематология ва кон қуйиш институти
2. Тошкент тиббиѐт академияси 3-клиникаси
3. 7-тошкент шахар клиникаси
«Глилагин-0.005г таблеткалари» дори шакли гемостатик фаоллиги
бўйича ижобий натижалар ва хулосалар олиниб Фармакология Қўмитасига
топширилди.
Шунингдек «Лаговин» дори воситаси субстанцияси ва дори шакли учун
ҳам ПМР-спектроскопияси усули танланди. Спектрал усул натижаларига
асосан субстанция 6,1
±
0,3% таъсир этувчи модда сақлаган (назарий 6.25%).
Шунингдек, юқорида келтирилган фикрларни инобатга
олган ҳолда,
фармакопея усули сифатида лаговиннинг миқдорий анализи учун биологик
усул ҳам таклиф қилинди. «Лаговин» препарати таклиф қилинган терапевтик
дозада назоратга нисбатан 4-5 баробар тезроқ ва 70-90 секунд оралиғида
паренхиматоз қон кетиш жараѐнини тўхтатиши кўрсатилди.
«Лаговин» субстанциясини олишнинг технологик усулига асосан
назирийга нисбатан 93-95% унум билан маҳсулот олиш имконини беради.
Лаговин дори воситасининг дори шакли (0.15% эритма):
Субстанция-1,5 г; инъекция учун сув - 1л гача.
Препаратнинг (0.15% Лаговин
эритмаси) тўлиқ фармако
токсикологик изланишлари олиб
борилган ва таъсир этувчи дозаси
аниқланган. «Лаговин» субстанцияси
ва дори шакли учун ВФМ ишлаб
чиқилган. 2012 йилда «Иммуномед»
ХК да 2500 дона ампула, 2016 йилда
«Узхимфарм» АЖ базасида яна 6000
дона апмулани қуйиш ишлари амалга
оширилган.
Лаговин дори воситаси физик-кимѐвий хусусиятларини ўрганиш
натижасида препаратнинг дори шакли спецификацияси ишлаб чиқилган. ЎзР
ССВ «Гематология ва қон қуйиш» илмий текшириш институтида клиник
синовлар муваффақиятли амалга оширилгач, «Лаговин» препарати ЎзР ССВ
28
ДВ ТТСНҚ Бош бошқармасининг "ЛАГВ № 71/2.ПС/66.Уз.2015/660»
қарорига асосан, Республика онкология илмий марказида ва Тошкент шахар
Онкология диспансерида 2-босқич клиник синовлари ўтказилмоқда. Ишлаб
чиқилган «Лаговин» препарати самарадорлиги жиҳатидан «Лагоден» дан
қолишмаслиги, нисбатан кам дозада таъсир қилиши ва олиш технологияси
афзаллиги билан фарқ қилади.
ТГК олиш технологияси асосида яллиғланишга қарши қўлланиладиган
Глицирам препарати субстанцияси ишлаб чиқилган. Субстанция ва
«Глицирам 0,05г таблеткалари» нинг спецификациялари ишлаб чиқилди.
Фармакология Қўмитасининг қарори билан ЎзР ССВ Тошкент тиббиѐт
академияси даволаш факультетининг ―Факультетлик ва госпитал терапияǁ
бўлимида чекланган клиник синовларини ўтказишга рухсат олинди. Клиник
синовлар муваффақиятли амалга оширилди ва олинган ижобий ―Ҳисоботǁ
ЎзР ССВ Фармакология Қўмитасига, саноат миқѐсида ишлаб чиқаришга
рухсат олиш учун топширилди. «Глицирам 0,05г таблеткалари» учун Саноат
Регламенти ишлаб чиқилган ва тасдиқланган.
ХУЛОСАЛАР
1. Илк бор катализаторлар қўллаш орқали лагохилиннинг ароматик
ацеталлари синтез қилинди. Ароматик ҳалқада гидроксил гуруҳи тутган
бирикмалар учун катализатор сифатида сувсиз мис сульфати, алкокси
гуруҳлари тутганлари учун эса сульфат кислотасидан фойдаланиш зарурлиги
кўрсатилди.
2. Лагохилиннинг ацетил ва изопропилиден ҳосилаларининг фаоллиги
ўринбосарлар табиати ва эркин гидроксил гуруҳлар сонига боғлиқлиги
аниқлаган. Лагохилиндаги тўртта гидроксил гуруҳидан иккитаси ацетил
гуруҳларига алмашиниши гемостатик фаолликка таъсир этмайди, аммо тўлиқ
алмашиниши гемостатик фаолликнинг йўқолишига олиб келиши аниқланди.
3. Супрамолекуляр кимѐ усулларини қўллаб лагохилиннинг глицирризин
кислотаси ва унинг тузлари билан комплекслари олинди. Супрамолекуляр
комплекс бирикмалар тузилиши ИҚ-, ЯМР-спектрлари ва математик
моделлаш усуллари ѐрдамида тавсифланди, физик-кимѐвий константалари
аниқланди.
4. Супрамолекуляр комплекслар сувли эритмаларининг реологик
хусусиятларини ўрганиш орқали, улар турли хил тузилишдаги мицеллалар
ҳосил қилиши ҳамда, гидрофоб-гидрофоб таъсирлашиш ва водород боғлари
ҳисобига мувофиқлашганлиги кўрсатилди.
5. Ширинмия илдизидан техник глицирризин кислотасини олиш
технологияси ишлаб чиқилди, унинг асосида яллиғланишга қарши
қўлланиладиган препарат субстанцияси олинди. «Глицирам» субстанцияси ва
дори шакли стандартланди. ВФМ ишлаб чиқилди ва тасдиқланди, клиник
синовлари ўтказилди.
6. Лагохилин билан ГК ва унинг тузлари супрамолекуляр
комплексларнинг гемостатик фаоллигини қиѐсий ўрганиш натижасида,
29
ГКМАТ:Лагохилин (Глилагин) 2:1 нисбатдаги комплекси юқори фаолликка
эга эканлигини кўрсатди.
7. «Глилагин» препарати субстанцияси ва дори шакли учун тўлиқ
клиник олди фармако-токсикологик тадқиқотлари ўтказилди. ВФМ
лойихалари ишлаб чиқилди, дори шакли учун саноат регламенти
тасдиқланди.
8. Лагохилин ва N-поливинилпирролидоннинг сувда эрувчан
комплекслари олинди. Улардан 1:15 нисбатдаги комплекс (Лаговин) эритмада
турғун ва юқорироқ фаоллликка эга эканлиги аниқланди.
9. Гемостатик дори воситалари: перорал усулда қўлланиладиган «Глилагин
0,005г таблеткалари» ва вена қон томири орқали юбориладиган «Лаговин
0,15% эритмаси» ишлаб чиқилди, 2 та ихтирога патент олинди. Ушбу
препаратлар маҳаллий хом-ашѐ асосида яратилган ва паренхиматоз қон
кетишларида гемостатик восита сифатида қўллаш учун тавсия қилинади.
30
НАУЧНЫЙ СОВЕТ 14.07.2016.К/В/Т.13.01
ПРИ ИНСТИТУТЕ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ,
НАЦИОНАЛЬНОМ УНИВЕРСИТЕТЕ УЗБЕКИСТАНА,
ИНСТИТУТЕ ХИМИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ПО
ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
МАТЧАНОВ АЛИМЖАН ДАВЛАТБОЕВИЧ
СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ ЛАБДАНОВЫХ ДИТЕРПЕНОИДОВ,
ГЛИЦИРРИЗИНОВАЯ КИСЛОТА И РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНЫХ
ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
02.00.10 – Биоорганическая химия
(химические науки)
АВТОРЕФЕРАТ ДОКТОРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ
Ташкент – 2017
31
Тема
докторской
диссертации
зарегистрирована
под
номером
30.09.2014/В.2014.5.К74 в Высшей аттестационной комиссии при Кабинете
Министров Республики Узбекистан.
Докторская диссертация выполнена в Институте биоорганической химии.
Автореферат диссертации на трех языках (узбекский, русский, английский) размещен на
веб-странице по адресу (http://ss.biochem.uz) и Информационно-образовательном портале
«ZIYONET» по адресу www.ziyonet.uz.
Научный консультант: Далимов Давранбек Нигманович
доктор
химических наук, профессор
Официальные оппоненты: Азизов Умархон Мухтарович
доктор химических наук, профессор
Дусматов Азиз Файзаматович
доктор фармацевтических наук, доцент
Абдулладжонова Нодира Гуломжановна
доктор химических наук
Ведущая организация: Ташкентский фармацевтический институт
Защита состоится «____» февраля 2017 г. в ____ часов на заседании Научного совета
14.07.2016.К/В/Т.13.01 при Институте биоорганической химии АН РУз, Национальном
Университете Узбекситана, Институте химии растительных веществ по адресу: 100170, г.
Ташкент, ул. М.Улугбека, 83. Тел: (99871) 262-35-40, факс: (99871) 262-70-63.
С докторской диссертацией можно ознакомиться в Информационно-ресурсном
центре Института биоорганической химии. Адрес: 100125, г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека,
83.Тел.: 262 35 40, факс: (99871) 262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru).
Автореферат диссертации разослан «____» февраля 2017 г.
(реестр протокола рассылки №_____ от _____ февраля 2017 г.)
Ш.И.Салихов
Председатель Научного совета по присуждению
ученой степени доктора наук, д.б.н., академик
М.И.Асраров
Ученый секретарь Научного совета по присуждению
ученой степени доктора наук, д.б.н., профессор
А.А.Ахунов
Председатель Научного семинара при Научном совете
по присуждению ученой степени доктора наук,
д.б.н., профессор
32
ВВЕДЕНИЕ (аннотация к докторской диссертации)
Актуальность и востребованность темы диссертации.
На
сегодняшний день в мире, при хирургических операциях больных с
диффузными кровотечениями, в 30% случаев наблюдается летальный исход.
По статистике, каждый год, около 30 млн. жителей Земли умирают от
различных видов кровотечений. Профилактика кровотечений в ранний
послеоперационный период, при сложных оперативных вмешательствах,
требуют дорогостоящих гемостатических средств. Анализ литературных
данных свидетельствует о том, что еще нет эффективных гемостатических
препаратов местного и внутривенного применения, которые можно было бы
использовать с достаточной гарантией надежности эффекта. Все это
показывает
актуальности
и
необходимости
дальнейших
поисков
гемостатических средств общего и местного действия.
В годы независимости нашей республики по разработке эффективных
лекарственных средств на основе местного растительного сырья,
проведенные расширенные мероприятия на высоком уровне привели к
определенным
результатам. При этом важно подчеркнуть созданные
эффективные лекарственные средства (с антиаритмическим свойством
«Аллапинин», гемостатик «Лагоден», противоникотиновые «Табекс» и
«Анабазин
гидрохлорид», антигерпетик «Мегосин», противовирусный
«Рагосин») на
основе низкомолекулярных природных соединений и
экстрактов лекарственных растений, являющихся источниками алкалоидов,
полифенолов, изопреноидов, стероидов.
На сегоднящий день в мире создание новых гемостатических
лекарственных средств на основе производных природных соединений и
терпеноидов является актуальной задачей. При этом проведение
исследований по разработке на основе растительных ресурсов новых
эффективных
лекарственных средств: получение супрамолекулярных
комплексов,
разработка новых гемостатических средств, выделение
биологически
активных
соединений
из
растения, определение
физиологической активности
и реологических свойств терпеноидов,
определение взаимосвязи структура
активность с целью поиска новых потенциальных биологически активных
соединений, установление механизма действия гемостатических препаратов и
другие являются актуальными задачами.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит
выполнению
задач,
предусмотренных
Постановлением
Президента
Республики Узбекистан № ПП-916 от 15 июля 2008 года «О дополнительных
мерах по стимулированию внедрения инновационных проектов и технологии
в производство», а также другими нормативно-правовыми документами,
принятыми в данной сфере.
Соответствие
исследования
приоритетным
направлениям
развития науки и технологий в Республике
. Данное исследование
выполнено в соответствии приоритетного направления развития науки и
технологий республики VI. «Медицина и фармакология».
33
Обзор зарубежных научных исследований по теме диссертации
.
1
Научные исследования, направленные на поиск, выделение биологически
активных терпеноидов из растений, определение взаимосвязи структура -
активность и разработке на их основе эффективных гемостатиков,
проводятся в ведущих научных центрах и высших образовательных
учреждениях мира, в том числе, Department of Pharmacy Practice,
Southwestern Oklahoma State University, (США). University of Mansoura
(Египт), Shanghai University of Traditional Chinese Medicin (Китай),
Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений (Россия),
Институте химии растительных веществ, Национальном университете
(Узбекистан).
По результатам научных исследований, проведенных в мире, по поиску,
выделению биологически активных терпеноидов из растения, определению
химической структуры и активности, разработке на их основе эффективных
гемостатиков получены ряд научных результатов, в том числе: разработаны и
оценены эффективность и безопасность местных гемостатических
препаратов на основе растительного сырья (Department of Pharmacy Practice,
Southwestern Oklahoma State University, США); синтетическое вешество-
н-бутил-2-цианоакрилат применено в качестве кровоостанавливающего
вещества при проведении челюстно-лицевой хирургии (University of
Mansoura, Египт); проанализирован химический состав растения
Lagochilus
ilicifolius
, идентифицированы с помощью спектрального анализа 3 ранее не
описанные вещества (Shanghai University of Traditional Chinese Medicin,
Китай); на основе тритерпеновых сапонинов солодки, глицирризиновой
кислоты и еѐ производных и различных флавоноидов растения солодки
получены супрамолекулярные комплексы (Всероссийский институт
лекарственных и ароматических растений, Россия); определены
физико-химические, спектральные свойства сапонинов, флавоноидов корня
солодки (Самарский государственный медицинский университет, Россия).
В мире по поиску и выделению природных терпеноидов из растения,
определению структуры и активности, разработке на их основе эффективных
гемостатиков по ряду приоритетных направлений проводятся исследования,
в том числе: синтез и определение биологической активности лабдановых
дитерпеноидов; установление структуры-активности для поиска новых
потенциальных биологически активных природных соединений; разработка
гемостатических лекарственных средств; определение реологических свойств
комплексных соединений; доказание механизма действия гемостатических
лекарственных средств.
Степень изученности проблемы.
Растения рода
Lagochilus
издавна
известны своими ценными лечебными свойствами и входят в число широко
используемых лекарственных растений Востока. Одним из
1
http://lektrava.ru/encyclopedia/zaytsegub-opyanyayushchiy, http://floruz.uz/content/lagochilus-pubescens-vved.
http://www.niscair.res.in / Science Communication / Abstracting Journals.
34
распространенных видов рода
Lagochilus
является растение
Lagochilus
inebrians
–Лагохилус опьяняющий. Установлено, что основным действующим
веществом является лагохилин. Однако, нерациональное использование
запасов дикорастущего Лагохилуса привело к тому, что в настоящее время
это растение внесено в Красную книгу.
Зарубежными учеными H.A. Scheraga, M. Khalili, A. Liwo, Y. Zhang,
R.F. Murray, H.W. Harper, D.K. Granner, P.A. Mayes, A.F.Gammermanами
проведены поиск, изучение структуры, биологических свойств ди и
тритерпеноидов, выделенных из объектов растительного и животного
происхождения.
В странах СНГ исследования, посвященные изучению состава и
биологической активности производных лагохилина из растения рода
Lagochilus inebrians
проведены учеными С.П.Боткиной, И.П.Павловой,
Г.В.Лазуревским. Учеными научной школы Г.А.Толстикова проводятся
углубленные научные исследования по изучению комплексных соединений
на основе глицирризиновой кислоты и еѐ солей, физико-химической
характеристике и механизму действия полученных соединений.
Растение
Lagochilus inebrians
подвергнуто тщательному химическому
анализу в работах ученых И.Э.Акопова, О.С.Садыкова, Т.П.Пулатовой,
М.И.Икрамова, И.И.Ибрагимова, Т.Р.Абдурахманова, С.Ауелбекова, М.М.
Абрамова, У.Н Зайнутдинова, Д.Н Далимова и др. Показано, что листья и
цветки растения Лагохилус содержат дитерпеноид – лагохилин. Содержание
лагохилина в надземных органах растения распределено неравномерно.
Больше всего его в листьях (1,98%), репродуктивных органах (0,84—1,87%)
и меньше всего в стеблях (0,15% от воздушно-сухой массы растений).
На
основе
производного
лагохилина
создан
эффективный
водорастворимый
отечественный
кровоостанавливающий
препарат
«Лагоден», являющиеся натриевой солью лагохирзиновой кислоты. В
настоящее время в Республике гемостатические препараты не производятся.
Основной арсенал кровеостанавливающих препаратов являются завозным.
Связь темы диссертации с научно-исследовательскими работами
научно-исследовательского
учреждения,
где
выполнена
работа.
Диссертационная
работа
выполнена
в
рамках
плана
научно
исследовательских
работ
и
прикладных
проектов
Института
биоорганической химии согласно Государственной научно-технической
программе П-15.20 «Создание и разработка гемостатика для внутривенного
введения – Лаговин из местного растительного сырья» (2003-2005), А-10-053
«Создание и разработка гемостатического средства местного действия, в виде
рассасывающиеся пленки из коллагена» (2006-2008), ФА-А12-Т175
«Разработка технологии лекарственных форм противовоспалительного
препарата «ГЛАС», местного гемостатического препарата «Глилагин» и
гемостатика для внутривенного введения (2009-2011), ИФА 2012-6-4
«Освоение технологии получения лекарственной формы гемостатика -
«Лаговин» для внутривенного введения, проведение клинических испытаний
и выпуск опытной партии» (2012-2014), ФА-И11-ТО11 «Освоение
35
технологии производства гемостатика – Глилагина и разработка технических
условий получения лагохилина» (2015-2016).
Целью исследования
является синтез производных лабдановых
дитерпеноидов, супрамолекулярных комплексов на основе глицирризиновой
кислоты и ее солей, низкомолекулярного полимерного носителя, определение
физико-химических свойств, а также разработка новых гемостатиков.
Задачи исследования:
выделение и очистка дитерпеноида лагохилина из растения
Lagochilus
Inebrians
, химическая модификация и изучение физико-химических
характеристик;
выделение и очистка глицирризиновой кислоты из корня солодки,
разработка опытно-промышленного регламента получения моноаммониевой
соли глицирризиновой кислоты;
получение супрамолекулярных комплексов лагохилина с ГК и МАСГК
в различных соотношениях и изучение физико-химических и спектральных
характеристик, реологических свойств водных растворов в зависимости от
соотношения образующих комплексы компонентов с целью установления
природы взаимодействующих сил между компонентами;
определение гемостатических свойств полученных производных
лагохилина и супрамолекулярных комплексов, для выявления зависимости
структура – активность, структура – соотношение компонентов образующих
супрамолекулярные комплексы и передача наиболее активных для
углубленных фармако-токсикологических исследований;
методами математического моделирования определить наиболее
вероятную структуру полученных соединений;
разработка проектов лабораторного и опытно-промышленного
регламентов технологии получения субстанции наиболее активных
разрабатываемых гемостатиков;
стандартизация субстанций гемостатиков «Глилагин» и «Лаговин»,
разработка их лекарственных форм для перорального применения (таблетки)
«Глилагин» и для внутривенного введения «Лаговин».
Разработка проектов ВФС на субстанции и лекарственные формы
гемостатиков «Глилагин» и «Лаговин» и передача их в Главное Управление
по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники МЗ
РУз.
подготовка НТД для получения разрешения и проведение клинических
испытаний в клиниках МЗ РУз в качестве оригинальных гемостатических
препаратов.
Объектами исследования
являются растения
Lagochilus Inebrians
и
Glycyrrhiza Glabra
. Глицирризиновая кислота, лагохилин и его ацетильные,
бензилиденовые и изопропилиденовые производные, N
поливинилпирролидон, супрамолекулярные комплексы.
Предметом исследования
являются физико-химические,
реологические свойства биологически активных соединений, биологическая
36
активность и стандартизация лекарственных форм, создание гемостатических
препаратов.
Методы исследования
. В диссертации для выделения и очистки
индивидуальных ди и тритерпеноидов применены методы экстракции,
высокоэффективной жидкостной хроматографии, газовой хроматографии;
для установления химической структуры новых соединений применены
физико-химические методы исследований: ультрафиолетовая, инфракрасная
спектроскопия и спектроскопия ЯМР, квантово-химические расчетные
методы с использованием пакетов программ Chem Office 9.0 и Hyper Chem;
для стандартизации применены фармакопейные методы контроля качества
лекарственных средств и биологические методы.
Научная новизна работы
заключается в следующем
:
синтезированы новые ароматические ацетали лагохилина и
установлено влияние катализаторов на выход конечного продукта; определена
взаимосвязь гемостатической активности ацетильных и изопропилиденовых
производных лагохилина от природы заместителей и количества свободных
гидроксильных групп;
получены новые супрамолекулярные комплексы глицирризиновой
кислоты и еѐ моноаммониевой соли с лагохилином;
установлена
мицеллярная
структура,
устойчивость
и
термодинамические
свойства
супрамолекулярных
комплексов
глицирризиновой кислоты, еѐ солей с лагохилином в водных растворах и
определена количественная зависимость биологической активности от
соотношения
и
от
химической
структуры
комплексообразующих
компонентов;
определением реологических свойств водных растворов комплексных
соединений, доказано включение лекарственного препарата в мицеллу, как
правило, с выигрышем энергии образования;
доказана
энтропия
системы
(самоорганизация
мицеллярных
образований), которая зависит от структурных и функциональных
особенностей гостевой молекулы, оказывающей стабилизирующее действие
на
процессы
структурирования
мицелл,
состоящих
из
молекул
глицирризиновой кислоты.
Практические результаты исследования.
Разработаны две новые
субстанции гемостатических препаратов и их лекарственные формы в виде
перорального (таблетки) и внутривенного (ампулы на 2мл 0,15% раствор)
применения. Осуществлен выпуск опытной партии субстанций «Глилагин» и
«Лаговин». Налажен выпуск опытной партии лекарственных форм:
«Таблетки Глилагин-0,005г» и «0,15% раствор Лаговина». Получено
разрешение на проведение клинических исследований гемостатика в виде
инъекционной формы Лаговин (0,15% раствор) и Глилагин (таблетки).
Налажен выпуск промежуточного технического продукта получения
глицирризиновой кислоты.
Достоверность полученных результатов
подтверждается тем, что они
получены с применением современных физико-химических методов,
37
практическая реализация результатов, представление результатов на
республиканских и международных научных конференциях, публикации
результатов исследований в рецензируемых научных изданиях и получением
патентов.
Научная и практическая значимость результатов исследования.
Научная значимость результатов исследования заключается в том, что
выделены лагохилин и глицирризиновая кислота, синтезированы ряд
производных лагохилина, получены новые супрамолекулярные комплексные
соединения на их основе. Изучена гемостатическая активность производных
лагохилина и установлена еѐ зависимость от химической структуры.
Структуры соединений подтверждены использованием физико-химических и
расчетных методов. При изучении реологических свойств комплексов,
установлено, что их мицеллярные состояния стабилизированы за счет
гидрофобно-гидрофобных взаимодействий и водородных связей.
Практическая значимость работы заключается в том, что на основе
полученных
супрамолекулярных
комплексов
созданы
эффективные
отечественные кровоостанавливающие средства «Глилагин» и «Лаговин»,
разработаны лабораторные и промышленные регламенты, а также проекты
ВФС на лекарственные формы «Таблетки Глилагин-0,005г», «Лаговин 0,15%
раствор», которые позволяют организовать промышленный выпуск
гемостатических препаратов.
Внедрение результатов исследований:
В результате выделения биологически активных терпеноидов из
растения, определения структуры и активности, на основе разработки
эффективных гемостатиков:
разработан отечественный гемостатический препарат внутривенного
применение Лаговин, получен патент (04.12.2013, № IAP 04806) на
изобретения Агентства по интеллектуальной собственности Республики
Узбекистан. Гемостатик рекомендован для применения при паренхиматозных
кровотечениях;
на основе «Глилагина» создана гемостатическая коллагеновая пленка,
получен патент (13.10.2015, № IAP 05109) на изобретение Агентства по
интеллектуальной собственности Республики Узбекистан. Разработанная
отечественная лекарственная форма применена для предотвращения
сосудистых и капиллярных кровотечений;
разработана и утверждена «Временная фармакопейная статья» на
субстанцию ―Глицирамǁ (18.10.2013. ВФС 42 Уз 2369-2013), проведены
клинические
испытания
таблеток
препарата
в
качестве
противовоспалительного средства. Полученный препарат даст возможность
Республике импортзамещение препаратов аналогичного действия.
Апробация результатов исследования.
Результаты исследования изложены
в виде презентации и прошли апробацию на 7 республиканских и 5
международных конференциях, в т.ч. «Биология-наука XXI века» (Пущино,
2005); «6
th
International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds»
(Анкара, 2005); «Современные проблемы биохимии и эндокринологии»
38
(Ташкент, 2006); «Актуальные проблемы биологии, экологии и почвоведения»
(Ташкент, 2006); «Актуальные проблемы химии природных соединений»
(Ташкент, 2009); «Проблемы органической химии» (Москва, 2009);
«Renewable Wood and Plant Resorches: Chemistry, Technology, Phrmacology,
Medicine» (Санкт-Петербург, 2011); «International Symposium on the Chemistry
of Natural Compounds» (Урумчи, 2011); «Клиническая гемостазиология и
гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2013); «Актуальные
проблемы развития биоорганической химии» (Ташкент, 2013);
Опубликованность результатов исследования
. По теме диссертации
опубликовано всего 40 научных работ. Из них 11 научных статей, в том числе
9 в республиканских и 2 в зарубежных журналах, рекомендованных Высшей
аттестационной комиссией Республики Узбекистан для публикации
основных научных результатов докторских диссертаций, получено 2 патента
на изобретение, утверждены 2 промышленных регламента и 1 ВФС.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, семи
глав, заключения, списка использованной литературы, приложений. Объем
диссертации составляет 182 страниц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении
обосновывается актуальность и востребованность
проведенного исследования, цель и задачи исследования, характеризуются
объект и предмет, показано соответствие исследования приоритетным
направлениям развития науки и технологий республики, излагаются научная
новизна и практические результаты исследования, раскрываются научная и
практическая значимость полученных результатов, внедрение в практику
результатов исследования, сведения по опубликованным работам и структуре
диссертации.
В первой главе диссертации «
Структура, биологические свойства ди
и тритерпеноидов растений рода
Lagochilus Inebrians
и
Glycyrrhiza Glabra
»
приводится обзор литературных данных об ареале растений вида Лагохилус,
химическом составе, методах модификации и выделения производных
лагохилина. Приведены также данные о полисахаридах, пектинах, гликозидах
и тритерпеноидах солодки, об основном действующем веществе растения –
глицирризиновой кислоте, структуре, трансформации, биологической
активности и коллоидно-химических свойствах еѐ солей и комплексов с
лекарственными веществами.
Во
второй
главе
диссертации
«
О
системе
гемостаза
и
гемостатические препараты
» приведены литературные данные о системе
гемостаза, нарушениях системы, о гемостатических препаратах и механизме
их действия.
В третьей главе диссертации «
Материалы, условия и современные методы
исследования, биологическая активность»
приведены материалы,
реактивы, приборы, системы тонкослойной хроматографии, методики
выделения и очистки лагохилина и глицерризиновой кислоты (и еѐ солей),
39
получения их производных, а также методы количественного определения и
гемостатической
активности,
использованные
при
выполнени
диссертационной работы.
В четвертой главе диссертации «
Выделение лагохилина ГК и еѐ
солей,
синтез производных лагохилина»
обсуждены данные по
усовершенствованию выделения дитерпеноида лагохилина из растения
Лагохилус опьяняющий и технологической схемы выделения ГК и еѐ солей из
ТГК, кристаллической структуре моногидрата лагохилина и синтезу его
ароматических ацеталей.
Усовершенствование выделения лагохилина из растения Лагохилус
опьяняющий заключается в том, что дихлорэтан для экстракции используется
13-14 раз (оптимально 10 - 11 раз), что приводит к экономии электроэнергии,
расхода растворителя и общего времени экстракции.
Лагохилин
перекристаллизовывают
из
ацетона
и
при
перекристаллизации
из различных растворителей получают 2 вида
кристаллов: безгидратной и моногидратной формы. Рентгеноструктурные
данные были получены в лаборатории физико-химические методы анализа
под руководством профессора Ибрагимова Б.Т. Монокристалл лагохилина в
виде
моногидрата
был
получен
из
смесей
растворителей:
ацетон:толуол:этанол. Структура монокристалла была определена методом
рентгеноструктурного анализа (РСА).
Синтезы на основе лагохилина с ароматическими альдегидами,
логически изменяющейся структурой до настоящего времени не были
изучены. Поэтому было интересно изучить реакцию лагохилина с рядом
ароматических альдегидов и выявить оптимальные условия синтеза. Синтез
осушествлен по
нижесдедующей схеме:
CH
2
OH
O
HOH
2
C
HO
CH
2
OH
CH
2
OH
+
СНО
R R 1 2
R
1
O
R
O
O
CH
2
OH
2
Где R
1
и R
2
– ОН, -ОСН
3
, -ОС
2
Н
5
,-Вr. (II.1- II.8)
Схема 1. Общая схема синтеза ароматических ацеталей лагохилина
Показано, что при синтезе ароматических ацеталей лагохилина, содержащие
различные алкоксильные группы в качестве заместителей в ароматическом
кольце целесообразно использование в качестве катализатора конц. Н
2
SO
4,
а
когда заместителями являются ОН – группы, безводного сульфата меди. Все
полученные ароматические ацетали лагохилина очищали методом
колоночной хроматографии. Некоторые физико-химические характеристики
приведены в таблице 1. Структуру синтезированных соединений
подтверждали данными ИК и ПМР-спектров.
В ИК-спектрах синтезированных соединений в области 3300-3400 см
-1
обнаруживается широкая полоса, относящаяся к валентным колебаниям
гидроксильных групп в положениях 15,16 молекулы лагохилина, которые
40
участвуют в образовании меж- и внутримолекулярных водородных связей, а
валентные колебания гидроксильных групп фенольных соединений
обнаруживются в области 3200 см
-1
(соединения 4-8).
В спектрах ПМР соединений 4- 8, в области 0,80-0,90 м.д. имеются
синглетные сигналы протонов метильных групп при С
8
и С
10
, а в области 1,0
м.д. сигнал протонов метильной группы при С
4
молекулы лагохилина. В
области 3,4-4 м.д. обнаруживаются сигналы протонов –ОСН
2
-групп при С
15
,
С
16
и С
18
, а в области 5,5 м.д. – сигнал третичного протона СН- группы.
Таблица 1
Некоторые физико-химические характеристики 3,18-бензилиден-15,
16-диокси-9,13-эпоксилабданов
№
Ar
Rf*
Катализатор
Т
пл.
С
о
Выход %
2
OCH
3
0,73
Н
2
SO
4
(конц.)
-
55
3
H
3
CO
OCH
3
0,26
Н
2
SO
4
(конц.)
-
60
4
OH
0,50
СuSO
4
(безвод.)
136-137
35
5
OH
HO
0,38
СuSO
4
(безвод)
138-139
27
6
OH
OCH
3
0,45
СuSO
4
(безвод)
150-151
25
7
OH
OC
2
H
5
0,41
СuSO
4
(безвод)
167-168
30
8
OH
Br
0,40
СuSO
4
(безвод)
173-174
36
*Система: метанол:ацетон (2:1)
Далее были синтезированы ацетильные производные лагохилина. В
литературе имеются много сведений о синтезе тетраацетильного
производного лагохилина. Но очень мало сведений о синтезе моно-, ди- и
триацетильных производных; они в основном были выделены из
растительных источников. Поэтому нами было синтезировано тетраацетил
производное лагохилина и мягким гидролизом продукта получены моно-, ди-
41
и триацетильные производные, которые были разделены методом колоночной
хроматографии.
Эффективность
и
биодоступность большинства биологически
активных веществ, проявляется в водной среде (человеческий организм
состоит из 60-75% из структурированной воды), поэтому нам важно было
кроме выделения, получения солей и производных ГК выяснить
фундаментальные вопросы, в частности физико-химические характеристики
водных растворов полученных супрамолекулярных комплексов. Полученные
результаты
этих
работ
могут
послужит
основанием разработки
высокотехнологичных эффективных гемостатиков широко спектра действия.
Для увеличения биодоступности того или иного биологического
активного вещества, используют различные химические приемы: получение
соответствующих солей (если это не затрагивает основную биологическую
функцию вещества); ковалентная или нековалентная модификация с
доступными, разрешенными в медицинской практике полимерными
транспортными агентами; получение супрамолекулярных комплексов с
такими низкомолекулярными носителями (лигандами), как циклодекстрины,
краун эфиры. В последние десятилетия широко используют амфифильные
природные соединения, в частности ГК и еѐ соли. В качестве носителя для
получения новых лекарственных (транспортных) форм известных лекарств
(нестероидных противовоспалительных средств, простагландинов, урацилов)
β
–
и других биологически активных веществ была предложена 18
глицирризиновая кислота (ГК). Исходной предпосылкой этого подхода
является
представление
об
обязательном
наличии
в
структуре
комплексообразователя
как
гидрофильной
(связывающей
основное
лекарственное вещество), так и гидрофобной (отвечающей за транспорт)
части. Так как лагохилин и полученные его изопропилиденовые, ацетильные
и бензилиденовые производные плохо растворимы в воде, в качестве
солюбилизирующего агента были выбраны ГК и еѐ некоторые моно- соли
(аммониевая, калиевая, литиевая).
Исходя из изложенного выше, в начале обсудим методы выделения ГК,
технологии очистки, подбора условий получения солей ГК и их
супрамолекулярных комплексных соединений с лагохилином. Методам
выделения ГК из корня солодки посвящено большое количество работ.
Основная суть их заключается в том, что на начальном этапе
технологического процесса получают качественный экстракт и сгущают
последний до нужной кондиции.
Нами было апробировано получение сырого технического продукта без
сгущения экстракта- методом сернокислого осаждения. Получают
техническую ГК (ТГК) с выходом до 9-11% и с содержанием ГК от 25% до
45%. Некоторые физико-химические характеристики ТГК приведены в
таблице 2.
42
Таблица 2
Некоторые физико-химические характеристики ТГК
№
Наименование показателей
Данные анализа
1
Внешний вид
Аморфно – твѐрдый, крупно
зернистый порошок темно-бурого
цвета
2
Вкус
Приторно-сладкий с горчинкой
3
Количественное
содержание ГК в %
40±5%
4
Влажность в %
5,5±1,5
5
Общая зола в %
11,4±0,75
Совместно с ООО «АгроБиоКимѐ» разработан «ТSh 19783536-02:2013»
ТГК. По разработанной технологии переработки солодкового корня на
производственном цеху ЧП «Баходир ва К» (г. Беруни, Республика
Каракалпакстан) получено 1,5 тонны ТГК.
Далее на основе ТГК получали ГК и еѐ соли. Данный технологический
процесс заключается в экстракции ГК ацетоном с последующим осаждением
получают монозамещенные соли с чистотой 72-75%.
еѐ в виде трехзамещенных солей, после чего кислотным гидролизом
Измельчение корня солодки
Обработка аммиачным раствором
Экстракция
фильтрование
Экстракт
Повторная
экстракция
Н
+
осаждение
фильтрование - сушка - фасовка
Схема 2. Технологический процесс выделение ТГК из корня солодки
43
1. ацетон
Техническая Глицирризиновая кислота
2. 10% КОН метанол
1. ацетон
2. 10% Li метанол
1. ацетон
2. 25% аммиак
Трикалиевая соль ГК
Трилитиевая соль ГК Триаммониевая соль ГК
Лед уксусная кислота
Лед уксусная кислота
Монокалиевая соль ГК 72-75% Монолитиевая соль ГК 72-75%
Моноаммониевая соль ГК 72-75%
перекристаллизация из 80% этанола
перекристаллизация из 80% этанола
Монокалиевая соль ГК 80-82%
Монолитиевая соль ГК 80-82%
Моноаммониевая соль ГК 80-82%
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
Глицирризиновая кислота
44
Схема 3. Технологическая схема выделения ГК и еѐ солей из ТГК
Полученная ГК и еѐ соли охарактеризованы физико-химическими и
спектральными данными. В таблице 3 приведены их некоторые физико
химические характеристики
.
Таблица 3
Некоторые физико-химические константы ГК и еѐ солей
№
Вещества
Внеш вид,
М.М.
Т.кип,
0
С
R
f *
[α]
D
,
0,5%
ИК
(ν, см
-1
)
УФ
(нм)
32
ГК
Порошок
белого цвета,
840
210-213
0,07(II)
0,14(V)
+48
1042,
1656,
2873,
251
2948,
33
МАСГК +3Н
2
О
Порошок светло
желтого цвета,
894
225-227 0,32 (VII)
0,06 (I)
+40
1042,
1655,
2948,
3239,
251
34
МКСГК
Порошок белого
цвета со
светло-жел тым
оттенком,
878
280-284
0,30 (VII)
0.26(II)
0.12(VI)
+36 1043, 1657
2948,3404
254
35
МЛСГК
Порошок
белого цвета,
878
250-253 0,30 (VII)
0.26(II)
+36 1037, 1664
2941, 3410
251
*Система:
I
-этанол:хлороформ (1:3), II -метанол:хлороформ (1:3), III -вода:ацетонитрил:ацетон
(3:4:2), IV -этанол:хлороформ (1,5:3), V -метанол:ацетон (2:1), VI -вода:ацетонитрил:ацетон (1:1:1).
Чистоту ГК и еѐ солей оценивали методом ВЭЖХ в изократическом режиме с
применением диодно-матричного и УФ детектора. Для этого навеску
препарата растворяют 0,5% ного раствора уксусной кислоты. Подвижная фаза
состоит из 35 объема ацетонитрила, 0,5 объема ледяной уксусной кислоты и
64,5 объема бидисстиллированной воды. Скорость потока устанавливают
0,75-1,0 мл/мин, детектирование проводят при длине волны 254 нм, время
анализа 16- 17мин.
Рис- 1. Хроматограмма МАСГК 80-85% чистоты
Из данной хроматограммы видно, что кроме основного пика имеются
пики сопутствующих веществ. По данным
1
Н-ЯМР спектроскопии,
сопутствующими веществами являются: 18
α
-Н изомер ГК и частично
гидролизованные производные 18
α
- и 18β глицирризиновой кислоты и
глицирретовая кислота. Общая сумма площадей пиков составляет 17
±
2,5%.
Дальнейшая очистка ГК достигается растворением его в ацетоне и
45
осаждением в виде тризамещенной соли и гидролизом последней ледяной
уксусной кислотой. После перекристаллизации получают продукт с чистотой
90-92%.
Рис- 2. Хроматограмма 100% ного МАСГК
Сопутствующие вещества близкие по строению очень трудно отделются.
Поэтому 100% чистота ГК достигается с помощью препаративного
колоночного разделения (рис. 2). Биологическая активность полученных
образцов МАСГК различной степенью чистоты: 70-75%, 80-82%, 90-92% и
100% практически не отличаются. При очистке происходит потеря продукта,
и выход конечного относительно первоначального продукта снижается до 25-
30%. Поэтому мы использовали ГК и еѐ солей с чистотой 80-82%. В пятой
главе диссертации «
Супрамолекулярные комплексы, физико-химические
и реологические свойства
» обсуждены экспериментально полученные
данные по спектральному подтверждению строения, определению
физико-химических констант и изучению солями.
реологических свойств супрамолекулярных комплексов лагохилина с ГК и еѐ
CH
2
OH
O
OH
COOH
H
H
O
O
C
O
OH
O
COOH
O
CH
2
OH
H
O
C
O
O
O
O
RO
HO
OH
HO HO
+n
RO
HO
C
OH
O
HO HO
O
H
O
C
OH
O
O
O
OH
HO
O
OH
HO
OH
n
Где R: H (5-7), H
4
N (8-10), K (11-13)
Схема 4. Общая схема получения супрамолекулярных комплексов
лагохилина с ГК и еѐ моноаммонийной и монокалиевой солями
46
Таблица 4
Некоторые физико-химические константы комплексов Лагохилина с
ГК, МАСГК, МКСГК.
№
Комплексы
Внеш вид,
М.М.
Т.
кип,
0
С
R
f *
[α]
D
,
0,5%
ИК
(ν, см
-1
)
УФ
(нм)
Выхо
д, %
36
Л-ГК 1:2
Пор. Белый
2036
173-17
5
0.74(
V)
+12
1044, 1082
1728, 2942
251
93,8
37
Л-ГК 1:4
Пор. Белый
3716
175-17
8
0.73(
V)
+16
1044, 1080
1730, 2945
251
92,5
8
Л-ГК 1:9
Пор. Белый
7916
180-18
3
0.73(
V)
+14
1044, 1081
1732, 2947
251
93,7
39
Л-МАСГК
1:2
Светло-желт
ый порошок,
2144
197-20
0
0.72(
V)
+24
1042, 1660
2943, 3384
250
90,0
40
Л-МАСГК
1:4
Светло-желт
ый порошок,
3932
202-20
4
0.72(
V)
+20
1042, 1662
2945, 3385
250
84,7
41
Л-МАСГК
1:9
Светло-желт
ый порошок,
8402
205-20
7
0.71(
V)
+22
1042, 1663
2946, 3386
250
88,7
42
Л-МКСГК
1:2
Светло-желт
ый порошок,
2112
215-51
7
0,18
(I)
0,1(I
I)
+24
1043, 1079
1655, 3410,
251
93,2
43
Л-МКСГК
1:4
Светло-желт
ый порошок,
3868
220-22
2
0.17
(I)
0.1(
II)
+12
1079, 1658,
2945, 3417
251
94,1
44
Л-МКСГК
1:9
Светло-желт
ый порошок,
8258
225-22
7
0.17
(I)
0.1(
II)
+16
1043, 1660,
1948,3430,
251
93,5
*Система: I
-
этанол : хлороформ (1:3), II
-
метанол : хлороформ (1:3), V
-
метанол:ацетон
(2:1),
Все полученные соединения (табл. 4) являются оптически активными,
правовращающими комплексами и выход супрамолекулярных комплексов
составляет от 84 до 93%, температура плавление веществ сопровождается
разложением.
В УФ спектре полученных соединений наблюдаются полосы
поглощения с максимумом при 251-254 нм в среде вода:спирт (50:50),
соответствующие к
р-р
*
переходу сопряженной двойной связи при С кольце
скелета агликоновой части молекулы ГК и еѐ солей.
В ИК спектрах полученных соединений наблюдаются характерные для
карбонильных групп ГК и еѐ солей валентные колебания при 1670-1650 см
-1
со смещением полос поглощения на высокочастотную область (60-55см
-1
)
относительно к исходным компонентам. Это указывает на то, что
карбонильные группы ГК и еѐ солей участвуют в образования
супрамолекулярных комплексов с лагохилином. Уширение сигнала
валентных колебаний гидроксильных групп лагохилина и ГК при 3430-3380
см
-1
также указывает на процесс комплексообразования.
В спектре ПМР (ацетон:D
2
O) комплекса ГК:Л (2:1) обнаружены
следующие резонансные частоты: сигнал в области 0,5 м.д. относится к
протонам C-CН
3
при C
17
; дублет в области 0,7-0,8 м.д. относится к протонам
СН-СН
3
при С
4
и С
10
молекулы лагохилина.
Сигнал в области 1,0 м.д. относится к протонам СН-СН
3
при С
4
в молекуле
ГК. Синглетный сигнал в области 1,3 м.д. относится к протонам С СН
3
при
С
20
. Нерасщепленный сигнал в области 1-2 м.д. относится ко всем
47
протонам скелета молекулы лагохилина. Сигнал протонов в области 2,8-3,0
м.д. относится к протонам метильных групп растворителя. Сложный сигнал в
области 3,0-4,5 м.д. относится ко всем протонам СН
2
О, СНО, имеющихся в
молекулах лагохилина и ГК. Синглетный сигнал в области 5,0–4,5 м.д.
относится к олефиновым протонам при С
12
.
На сегодняшний день, механизм гелеобразования и солюбилизации ГК
остается во многом непонятным и мало описанным в литературе. Поэтому
установление
основных
физико-химических
свойств
гидрогелей
низкомолекулярных природных соединений в различных агрегатных
состояниях и причин проявления высокой биологической активности
супрамолекулярных комплексов на основе ГК является актуальным.
Данный этап работы выполнено совместно с учеными кафедры «Химии
полимеров»
химического
факультета
Национального
Университета
Узбекистана (профессорами У.Н. Мусаевым и М.Г. Мухамедиевым).
Процессы структурообразования в растворах можно также охарактеризовать
изучением их вязкости. Если в растворах происходят процессы ассоциации
растворенных веществ, то вязкость растворов резко возрастает. Поэтому с
целью выявление ассоцированности молекул супрамолекулярных комплексов
была определена вязкость их водных растворов. Из рис. 4. видно, что водный
раствор молекулярного комплекса ГК с лагохилином в соотношении 2:1
обладает очень высокой вязкостью характерной для ассоциируемых систем.
При этом с увеличением температуры приведѐнная вязкость раствора
уменьшается. Этот факт свидетельствует о разрушении ассоциатов. Однако
для водного раствора молекулярного комплекса ГК с лагохилином (9:1)
увеличение температуры приводит к возрастанию вязкости
.
η
уд
/С
5
η
уд
/С
9
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5 1
0,5 0
8
1
7
6
5
3
4
3
2
2
1
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1
2
3
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
а
С,%
б
С,%
Рис.4. Зависимость приведѐнной вязкости водного раствора молекулярного
комплекса ГК с лагохилином 2:1(а) и 9:1 (б) от концентрации
при T=298K(1), T=303K(2), T=308K(3)
По-видимому, эти изменения обусловлены различным соотношением
гидрофильно-гидрофобных
взаимодействий
для
разных
составов.
Определением вязкости водных растворов МАСГК, супрамолекулярных
комплексов ГК и еѐ моноаммониевой соли с лагохилином установлено, что
включение в состав комплексов гидрофильных соединений приводит к
уменьшению, а гидрофобных соединений (лагохилин) к увеличению
вязкости их водных растворов по сравнению с вязкостью МАСГК. Эти
48
данные свидетельствуют о том, что при стабилизации супрамолекулярных
комплексов лагохилина основную роль играют водородные связи и
гидрофобно-гидрофобные взаимодействия. Для подтверждения этого
предположения нами методом математического моделирования по программе
«HyperChem 9,0» и «Chem-Draw» были рассчитаны энергии образования
супрамолекулярных комплексов лагохилина с ГК в «абсолютной среде»
(рис.4).
Рис 4. Кольцеобразное состояние Глилагина. Энергия обр. 787 kcal/mol
Наименьшей
энергией
обладают
водородные
связи
между
гидроксильными группами лагохилина в положениях 15 и 18 и гидроксилами
карбоксильной группы ГК. В шаровидной модели видно, что лагохилин
находится за пределами образованного кольца ГК. Исследование реологии
водных растворов супрамолекулярных комплексов показало, что включение
гидрофобных органических соединений в состав супрамолекулярных
комплексов ГК и еѐ моноаммониевой соли приводит к усилению, а
гидрофильных
органических
соединений-к
затруднению
мицеллообразования в водных растворах.
Поэтому наиболее вероятно, что молекулы гостя находятся между
слоями ГК и еѐ солей, которые находятся в мицеллярном состоянии (Рис 5).
Изучение структуры методом математического моделирования в модели
одного слоя, показало, что такое состояние супрамолекулярных комплексов
лагохилина с ГК, намного устойчивее и энергетический выгоднее, чем в
кольцеобразном состоянии
.
Энергия образования связей в мицелллярном состоянии в виде слоя в
два раза меньше, чем у кольцеобразного вида. Таким образом, квантово
химические расчеты состояния супрамолекулярных комплексов ГК и еѐ
солей с лагохилином показывают явную энергетическую несостоятельность
(невыгодность) модели супрамолекулярного комплекса кольцеобразного
типа. Полагаем, что комплекс лагохилина с двумя молекулами ГК является
промежуточным при переходе образования мицелл различного структурного
типа (сферические, бислойные, эллипсоидные).
49
Рис
5.
Мицеллярное состояние Глилагина. Енергия обр. 304. kcal/mol
.
Определением ККМ водных растворов комплексов ГК и еѐ солей с
лагохилином и другими веществами было показано, что ККМ молекулярного
комплекса МАСГК с гидрофобным веществом лагохилином ниже, чем у
самого МАСГК. Следовательно, включение в состав молекулярного
комплекса лагохилина оказывает стабилизирующее действие на процесс
структурирования молекул МАСГК.
В шестой главе диссертации «
Изучение гемостатической активности
супрамолекулярных комплексов
» приведены полученные данные по
определению гемостатической активности производных лагохилина,
молекулярных комплексов лагохилина с ГК, МАСГК и N-винилпир
ролидоном, изучению влияния препарата «Лаговин» на процесс свѐртывания
крови в опытах in vitro и его токсических свойств.
Гемостатическая активность всех соединений определена в лаборато
рии Фармакологии ИБОХ АН РУз под руководством к.б.н. Выповой Н.Л.
1
20
9
OCH
2
OR
4 15
O O
O O
OCH
2
OH
COONa
R
1
O
3 5
17
CH
2
OR
3
R
1
O
O
R
1
O
R
1
O
R
19
2
O
18
R
2
O
R
2
O
R
2
O
II.1, II.10- II.24 I.9, II.25-II.27 II.28- II.30 II.31 а
C
CH
3
CH
3
б
H
3
C CO
По химической структуре синтезированные производные лагохилина
можно подразделить на 3 группы: I. лагохилин, его изопропилиден- и
ацетильные производные (II.1, II.10-II.24); II. ангидро-лагохилины (II.9, II.25
II.27); III. дитерпеноидные лактоны (II.28-II.30). Эталон для сравнения -
гемостатическая активность препарата «Лагоден»а (100%). Все
исследованные соединения обладают в той или иной мере гемостатической
активностью (таблица-5).
50
Таблица 5
Гемостатическая активность лагохилина и его производных
№п\п
Заместители
Гемостатическая активность
R
1
R
2
R
3
R
4
%
сек
II.1
H
H
H
H
67
130,0±12,6
II.10
а
Н
Н
40
157,0±14,8
II.11
а
а
0
268,1±19,8
II.12
а
б
б
33
163,7±13,5
II.13
а
б
Н
32
165,0±14,7
II.14
б
Н
Н
Н
83
115,0±11,4
II.15
Н
Н
Н
б
82
116,0±10,8
II.16
Н
Н
б
б
83
115,0±10,5
II.17
б
б
Н
Н
84
114,0±10,6
II.18
б
Н
Н
б
83
115,0±10,6
II.19
б
Н
б
Н
83
115,0±11,0
II.20
Н
б
б
Н
83
115,0±11,0
II.21
Н
б
б
б
81
117,0±10,6
II.22
б
б
Н
б
83
115,0±11,2
II.23
б
б
б
Н
81
117,0±10,5
II.24
б
б
б
б
17
211,0±16,0
II.9
Н
Н
-
-
60
148,0±13,5
II.25
а
а
-
51
179,0±16,5
II.26
Н
б
-
-
68
129,0±13,0
II.27
б
Н
-
-
67
130,0±13,0
II.28
Н
Н
-
-
57
141,0±13,7
II.29
б
б
-
-
66
131,0±12.6
II.30
а
-
-
33
140,0±13,0
II.31
Контроль
100
98,0±10,0
*Р
<
0,01 по отношению к контролю
Рассматривая данные приведенные в таблице 5, следует отметить, 0,5%
раствор лагохилина в персиковом масле проявляет 67% активности по
сравнению с препаратом сравнения. При замещении гидроксильных групп
при С
3
и С
18
на изопропилиден в молекуле лагохилина гемостатическая
активность понижается до 40%, а дальнейшее замещение гидроксильных
групп при С
15
и С
16
на изопропилиденовые приводить к полной пери
гемостатической активности (соединение II.11).
Ангидролагохилин проявляет относительно слабую гемостатическую
активность (57%), то замещение гидроксильных групп при С
3
и С
18
изопропилиденовой группой приводит к уменьшению гемостатической
активности до 33% (II.30) . Замещение гидроксильных групп при С
13
и С
18
в
молекуле лагохирзина на ацетильные группы (соед. II.26, II.27), особому
изменению их гемостатической активности, не приводит (67%). Введение
51
изопропилиденовой
группы
в
молекулу
лагохирзина
снижает
гемостатическую активность до 51% (II.25), а вот раскрытие лактонного
кольца с образованием соответствующей натриевой соли 3,16,18- тригидрокси
– 9,13 – эпоксилабдан 15 овой кислоты приводит к резкому возрастанию
гемостатической активности 100% (II.31).
Сравнение гемостатической активности лагохилина (II.1),
ангидролагохилина (II.286), лагохирзина (II.9) при использовании водно
спиртовых растворов, указывает, что наибольшей активностью обладает
лагохилин 67%, лагохирзин 60% и ангидролагохилин 57%.
Таким образом, показано, что замещение двух или трѐх гидроксильных
групп молекулы лагохилина на ацетильные группы относительно не влияет
на кровоостанавливающую активность, лишь полное замещение
гидроксильных групп к ацетильным группам, приводит к уменьшению
гемостатической активности. Введение изопропилиденовых групп
отрицательно сказывается на гемостатической активности, что, возможно,
связано с усилением гидрофобности молекулы лагохилина.
С целью выявления наиболее оптимального соотношения компонентов,
определена специфическая гемостатическая активность
полученных
супра-молекулярных комплексов лагохилина с ГК и еѐ солями (табл. 6).
Полученные данные показывают, что исследованные комплексы
позволяют, в зависимости от природы и соотношения компонентов,
сократить время кровотечения в 2-4 раза. Высокую гемостатическую
активность
проявляли
супрамолекулярные
комплексы
МАСГК
с
лагохилином. С целью создания отечественного местного гемостатического
препарата, наиболее активный комплекс (МАСГК:Л=2:1), условно названный
«Глилагин»ом, рекомендован для
углублѐнных фармакологических
исследований.
Таблица 6
Время кровотечения у крыс через 60 минут после внутрибрюшинного
введения супрамолекулярных комплексов. (M
±
m; n=5)
№
Препарат
Время кровотечения
сек.
%
Р
1
Контроль, мг/кг
360
±
20
100
-
32
ГК:Л; 2:1, мг/кг
160
±
13
45
<
0,01
33
МАСГК: Л; 2:1,
мг/кг
85
±
61
24
<
0,01
34
ГК:Л; 4:1, мг/кг
165
±
14
46
<
0,01
35
МАСГК:Л; 4:1, мг/кг
100
±
10
28
<
0,01
36
ГК:Л; 9:1, мг/кг
185
±
16
51
<
0,01
37
МАСГК:Л; 9:1, мг/кг
120
±
12
33
<
0,01
52
Для субстанции «Глилагина» разработан проект ВФС, проведены
необходимые доклинические фармако-токсикологические и специальные
эксперименты по изучению гемостатической активности.
На основании полученных результатов по субстанции «Глилагина»
разработан состав лекарственной (перорально, таблетки по 0,005г) формы
«Глилагина». Проведены все требующиеся стандартные эксперименты для
создания проекта временной фармакопейной статьи (ВФС).
Применение пероральных лекарственных форм (л/ф) для остановки
паренхиматозных кровотечений во многих случаях не эффективно из-за
длительности времени достижения желаемого гемостатического действия.
Поэтому, обычно используют внутривенные формы препаратов. В Рес
публике производится единственный водорастворимый кровоостанавли
вающий препарат для внутривенного применения Лагоден (производный
Лагохилина). Но способ его получения требует большие энергетические
затраты, применения дорогостоящих растворителей, катализаторов и состоит
из пяти стадий синтеза с низким выходом конечного продукта (10- 12% от
исходного).
Поэтому
актуальным
является
вопрос
создания
водорастворимого, эффективного, недорогого гемостатика на основе
лагохилина. При этом технология получения субстанции препарата должна
быть простой, непожароопасной и недорогой.
Известно, что многие разрешенные к применению в медицинской практике
полимерные носители лекарственных средств изменяют физико химические
свойства основной субстанции, в частности они усиливают их
водорастворимость. Одним из таких веществ является N
поливинилпирролидон (ПВП).
сн сн
2
n
O
сн
2
он
сн сн
2
n
O
сн
2
он
сн
2
он
N O
HO
+
сн
2
он
N O
H O
H O X
HO
Y
Схема 5. Получение супрамолекулярных комплексов лагохилина с
N-поливинилпирролидоном
Низкомолекулярный ПВП, в виде раствора применяется в качестве
детоксиканта и выводится из организма в течение 2-3 дней полностью. Нами
был использован низкомолекулярный ПВП с м.м. 8000
±
2000Д. Комплексы
получали по схеме 5. Получены супрамолекулярные
комплексы
поливинилпирролидона с лагохилином в соотношениях 1:5, 1:10, 1:15 и 1:20.
Но из них более устойчивым и более активным оказался комплекс в
соотношений 1:15 (таб-7). Новый супрамолекулярный комплекс Лагохилина с
ПВП, условно названный нами «Лаговин» («лаго» - из слова «лагохилин»,
«вин» - из слова винилпирролидон), объединил в себе все положительные
свойства компонентов - обладает комплексным терапевтическим действием и
не уступает по гемостатической эффективности Лагодену и Дицинону.
Физико-химические параметры
53
приведены в таблице 7. Кроме того, получение Лаговина является
технологически довольно простым, а выход конечного продукта более 90%.
Таблица 7
Некоторые физико-химические свойства комплексов ПВП с
лагохилином
№ Комплекс Т пл
0
С
Растворимос
ть в воде %
ИК см
-1
Выход
%
38
ПВП:Л
5:1
95-96
100
не устойчив
1666 С=О, 2960
C-N 3436-3422
–OH
95-97
39
ПВП:Л
10:1
96-97
100
не устойчив
1661 С=О, 2951
C-N 3431-3426
–OH
94-96
40
ПВП:Л
15:1
98-100
100
1662 С=О, 2955
C-N 3435-3420
–OH
92-95
41
ПВП:Л
20:1
99-100
100
1667 С=О, 2958
C-N 3433-3428
–OH
91-94
Фармако-токсикологические испытания субстанции и лекарственной
формы проведены в лаборатории Фармакологии ИБОХ АН РУз, а
биохимические эксперименты на кафедре Биохимии биологического
факультета НУУз под руководством д.б.н. проф. Далимовой С.Н.
Стимулирование процесса свертывания крови и плазмы в опытах in
vitro было исследовано при различных концентрациях Лаговина (табл. 8).
Приведенные данные показывают, что при оптимальной концентрации (0,5%)
Лаговин активирует I и II фазы свертывания крови.
Таблица 8
Время свертывания цельной крови и плазмы при добавлении к ней
препарата Лаговин (М
±
m; n= 6)
Препараты
Концентра
ция,
%
Время свертывания, сек.
1мл крови
+0,1мл препарата
0,1мл плазмы +
0,1мл СаСI
2
+
0,1мл
препарата
0,2мл плазмы
+ 0,2мл
препарата
Физ.
Раствор
0,9
150,0
±
10,0
110,0
±
6,5
Не свернулась
СаСI
2
0,0277
-
-
78,0
±
6.6
Лаговин
0,1
100,0
±
10,0*
78,0
±
6,5*
Не свернулась
Лаговин
0,5
75,0
±
5,0*
60,0
±
4,0*
65,0
±
5,0
Лаговин
1,0
165,0
±
16,0
75,0
±
5,0*
96,0
±
8,0
*Р
<
0,01 по отношению к контролю
54
В седьмой главе диссертации «
Стандартизация субстанций и
лекарственных форм гемостатических препаратов
» приводятся результаты
по разработке и стандартизации лекарственных средств, субстанции и
лекарственных форм. На этапе стандартизации субстанции «Глилагин» была
учтена особенность химических свойств молекулы действующего вещества -
Лагохилин. Лагохилин представляет собой дитерпеноид с четырьмя
гидроксильными группами, но не имеющий в своем составе ярко
выраженной хромофорной группы и это создает, в свою очередь, затруднение
при его количественном определении стандартными спектральными
методами Исходя из этого, совместно с сотрудниками ИХРВ АН РУз, был
разработан метод его количественного определения ПМР- спектроскопией.
Теоретические расчеты показывают, что содержание лагохилина в
субстанции равно 17,18%. Методом ПМР спектроскопии было определено
содержание лагохилина в препарате «Глилагин» равное 17,5
±
1,13%, что
хорошо согласуется с теоретическими выкладками. Однако ПМР
спектроскопия не используется в фармакопейном анализе и, исходя из этого,
был предложен биологический метод количественного определения. Было
установлено, что препарат в терапевтической дозе должен останавливать
капиллярное кровотечение в интервале 60-100 сек и уменьшать время
кровотечения в 4-5 раз быстрее по сравнению к контролю.
Была разработана технологическая схема получения субстанции
«Глилагин». Выход конечного продукта по предложенной схеме составил
93-97% от теоретического. Полученные результаты по хроматографическому
анализу показывает, что субстанция «Глилагин» не содержит следов
органических растворителей.
Одним из важных показателей конечного продукта является
определение
остаточного
количества
органических
растворителей
использованных в процессе его получения. Этот анализ проводили на
приборе ГХ Clarus-400 Perkin Elmer (США) (рис. 6).
Рис 6. Хроматограмма субстанции Глилагина
55
По итогам исследования фармакологических свойств субстанции,
совместно с доцентом Ташкентского фармацевтического Института А.М
Усуббаевым, разработана лекарственная форма «Таблетки Глигагин 0,005».
Состав таблеток (
масса таблетки – 0,1 г.):
Глилагин – 0,005 г., Микрокристаллическая целлюлоза – 0,082г, Крахмал
картофельный - 0,012г, Кальция стеарат – 0,001 г,
Разработан и утвержден (совместно с ООО «Tash Farm A.I.»)
промышленный регламент производства таблеток Глилагина. Разработаны
проекты ВФС на субстанцию и л/ф, проведены доклинические фармако
токсикологические исследования, и решением Фармакологического комитета
Главного Управления по контролю качества лекарственных средств и
медицинской техники МЗ РУз («ГЛИГ №84/6.П/62.Уз.2012/381»), препарат
направлен на клинические испытания в следующих лечебных учреждениях
МЗ РУз:
1. Институт гематологии и переливания крови;
2. 3-ая клиника Ташкентской Медицинской Академии;
3. 7-Ташкентская городская клиника.
Полученные положительные отзывы и заключения по гемостатической
активности препарата «Таблетки Глигагин 0,005»
переданы в
Фармакологический Комитет.
Для количественного определения субстанции «Лаговин»а также был
выбран метод ПМР- спектроскопии. Спектральные данные показали, что
субстанция содержит 6,1
±
0,3% д/в (теор. содер. 6,25%). Учитывая
вышеизложенные соображения, в качестве фармакопейного метода также
был предложен биологический метод количественного анализа Лаговина.
Было установлено, что препарат в терапевтической дозе должен
останавливать капиллярное кровотечение в интервале 70-90 сек и уменьшать
время кровотечения в 4-5 раз по сравнению с контролем.
Разработана технологическая схема получения субстанции «Лаговин»,
которая позволяет получить продукт с выходом 93-95%, от теоретического.
Состав лекарственной формы Лаговина (0,15% раствор):
Субстанция - 1,5 г, вода для инъекции – до 1л
Проведены
полные
доклинические
фармако-токсикологические
исследования препарата, подобрана доза л/ф (Лаговин 0,15% раствор).
Разработаны ВФС для субстанцию и лекарственной формы «Лаговина». В
2012 году на базе ЧП «Иммуномед» осуществлен розлив препарата в
количестве 2500 ампул, в 2016 году в АО «Узхимфарм» проведен розлив в
количестве 6000 ампул.
56
На основе проведенных исследований по изучению физико химических
свойств Лаговина была разработана спецификация л/ф препарата. После
успешных испытаний на базе Научно исследовательского
Института Гематологии и
переливания крови МЗ РУз,
препарат Лаговин решением
ГУККЛС и МТ МЗ РУз ЛАГВ
№ 71/2.ПС/66.Уз.2015/660.
проходит 2-ой этап
клинических испытаний в
Республиканском Научном
центре онкологии и в
Городском Онкологическом
диспансере.
Разработанный препарат
Лаговин
не
уступает
по
эффективности Лагодену, действует в относительно малой дозе и отличается
высокой технологичностью получения.
На основе разработанной технологии получения ТГК разработана
субстанция противовоспалительного препарата Глицирам. Разработана
спецификация на субстанцию и лекарственную форму «Таблетка Глицирам
0,05г». Получено разрешение Фармакологического Комитета на проведение
клинических испытаний по ограниченной программе на базе кафедры
«Факультетской и госпитальной терапии» лечебного факультета Ташкентской
медицинской академии МЗ РУз. Положительный отчет ТМА передана в
Фармакологический Комитет МЗ РУз для получения разрешения на
промышленный выпуск препарата. Разработан и утвержден Промышленный
регламент «Таблетки Глицирам 0,05г».
ВЫВОДЫ
1. Впервые с использованием катализаторов синтезированы
ароматические ацетали лагохилина. Показано, что при наличии в
ароматическом кольце гидроксильных групп в качестве катализатора
необходимо использовать безводный сульфат меди, а для алкоксильных групп
- серную кислоту.
2.
Определена
взаимосвязь
активности
ацетильных
и
изопропилиденовых производных лагохилина от природы заместителей и
числа свободных гидроксильных групп. Установлено, что замещение двух из
четырѐх гидроксильных групп молекулы лагохилина на ацетильные группы
не влияет на кровоостанавливающую активность, однако полное замещение
приводит к потере гемостатической активности.
57
3. С использованием методов супрамолекулярной химии получены
комплексы лагохилина с глицирризиновой кислоты и ее солями. Структурные
особенности супрамолекулярных комплексов охарактеризованы ИК-, ЯМР-
спектрами и методами математического
моделирования, определены
некоторые физико-химические константы.
4. Определением реологических свойств водных растворов
супрамолекулярных комплексов показано, что они образуют мицеллы
различного строения, которые стабилизированы за счет гидрофобно
гидрофобных взаимодействий и водородных связей.
5. Разработана технология получения технической глицирризиновой
кислоты из корня солодки, на основе которого получена субстанция
противовоспалительного препарата. Проведены стандартизация субстанции и
лекарственной формы «Глицирам». Разработана и
утверждена ВФС,
проведены клинические испытания препарата.
6.
Сравнительная
оценка
гемостатического
действия
супрамолекулярных комплексов лагохилина с ГК и еѐ солей показала
высокую активность комплекса МАСГК: лагохилин (Глилагин) при
соотношении 2:1.
7. Проведены полные доклинические фармако-токсикологические
исследования субстанции и лекарственной формы препарата «Глилагин».
Разработаны проекты ВФС, утвержден промышленный регламент на
лекарственную форму.
8. Получены водорастворимые комплексы лагохилина с N
поливинилпирролидоном. Установлено, что наиболее активным и
стабильным в растворе является комплекс в соотношении 1:15 (Лаговин).
9. Разработаны гемостатические препараты: «таблетки Глилагин 0,005г» для
перорального применения и «0,15% раствор Лаговин» для внутривенного
введения, получены 2 патента на изобретение. Эти препараты разработаны на
основе местного сырья и рекомендуются в качестве гемостатиков для
остановки паренхиматозных кровотечений.
58
SCIENTIFIC COUNCIL ON AWARD OF SCIENTIFIC DEGREE OF
DOCTOR OF SCIENCES 14.07.2016.K/B/T.13.01 AT THE INSTITUTE OF
BIOORGANIC CHEMISTRY, THE NATIONAL UNIVERSITY OF
UZBEKISTAN, THE INSTITUTE OF CHEMISTRY OF PLANT
SUBSTANCES
INSTITITE OF BIOORGANIC CHEMISTRY
MATCHANOV ALIMJON DAVLATBOEVICH
SYNTHESIS OF THE DERIVATIVES OF LABDANE DITERPENOIDS,
GLYCYRRHIZIC ACID, AND THE DEVELOPMENT OF EFFECTIVE
HEMOSTATIC DRUGS
02.00.10 – Bioorganic chemistry
(chemical sciences)
ABSTRACT OF DOCTORAL DISSERTATION
Тashkent – 2017
59
Тhe subject of doctoral dissertation is registered by №30.09.2014/В2014.5.К74 at
Hidger Attestation Commission under Cabinet of Ministers of Republic of Uzbekistan.
Doctoral dissertation is carried out at the Institute of Bioorganic Chemistry. The abstract of the
dissertation in three languages (Uzbek, Russian, English) is placed on web page to address
information-educational portal «ZiyoNet» to address www.ziyonet.uz
Scientific consultant: Dalimov Davranbek Nigmanovich
doctor of chemical sciences, professor
Official opponents: Azizov Umarxon Muxtarovich
doctor of chemical sciences, professor
Dusmatov Aziz Fayzamatovich
doctor of pharmaceutical sciences, dotcent
Аbdulladjanova Nodira Gulomjanovna
doctor of chemical sciences
Leading organization: Tashkent Pharmaceutical Institute
Defence will take plase on «____» February 2016 at ____ at meeting of the Scientific
council 14.07.2016./К/В/Т.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry, the National
University of Uzbekistan, the Institute of the Chemistry of Plant Substances at the following
address: 100125, Tashkent, 83 M.Ulugbek street. Phone: 262 35 40, Fax: (99871) 262 70 63.
Doctoral dissertation is registred in the information centre at institute of Bioorganic
Chemistry which is available 100125, Тashkent, Mirzo-Ulugbek str., 83.Ph.: 262-35-40, fax:
(99871) 262-70-63. e-mail: asrarov54@mail.ru
Abstract of the dissertation sent out on «_____» February 2017 y.
(mailing report №____ on _____ February 2017 y.)
Sh.I.Salikhov
Chairman of scientific council on award of scientific
degree of doctor of sciences, D.B.S., akademik
M.I.Asrarov
Scientific secretary of scientific council on award of
scientific degree of doctor of sciences, D.B.S., professor
A.A.Akhunov
Chairman of scientific seminar under scientific council
on award of scientific degree of doctor of sciences, D.B.S., professor
60
INTRODUCTION (annotation to the doctoral thesis)
The topicality and relevance of the dissertation topic.
Today, in the world of
surgery with stoppage of diffuse bleeding atients of 30% of cases lead to fatal end.
According to statistics, each year about 30 million people on Earth die with various
bleeding. Prevention of leeding in the early postoperative period, with complex
surgical interventions requires expensive hemostatic agents. Analysis of the
literature indicates that still there is no effective l hemostatic agents for topical and
intravenous use, which could be used with sufficient guarantee of the effect of
reliability. All this demonstrates the needs for further searches for hemostatics with
of general and topical actions.
In the years of Independence of our Republic solving problems of
development and implementation of effective medicinal preparation on the basis of
local plant raw material, performed by an expanded high-level events have led to
certain results. On the basis of this low molecular weight natural compounds have
been created effective drugs, in particular: antiarrhythmic «Allapinin», hemostatic
«Lagoden», anti-nicotinic drug «Tabeks» «Anabasine hydrochloride» antiherpetic
«Megosin», antiviral drug «Ragosin» and others. Although most of these natural
substances possess high biological activity, but development of promising drugs on
the basis of these agents is limited due to their adverse properties such as toxicity,
high dose, poor water solubility, low availability, etc.
Today in the world, on the basis of biological active plant substances,
including the development on the basis of labdane diterpenoids and triterpenoids
new hemostatic agents has become a topical task. Production of supramolecular
complexes of glycyrrhizinic acid and its salts diterpenoid lagohilin, to create new
hemostatic agents based on lagochilin, synthesis and determination of biological
activities of labdane diterpenoids, determining the rheological properties, the study
of the structure-activity to search for new potential bioactive natural compounds;
evidence of the mechanisms of action of hemostatic agents is relevant.
This dissertation research serves to a certain extent the tasks provided for the
Resolution of the President of the Republic of Uzbekistan N PR-916 from 15 july
2008 yare "On additional measures to stimulate innovative projects and
technologies in production", as well as other legal documents adopted in this area .
Compliance of the research to the priority areas of science and
technology in the Republic.
This study was performed according to the priority directions of development
of science and technology of the Republic VI. "Medicine and Pharmacology".
Review of foreign scientific research on the topic of the thesis.
1
Research
aimed at the search, isolation of biologically active terpenoids from plants,
determination of structure activity and development effective hemostatics on their
basis are carried out in the leading research centers and higher educational
1
http://lektrava.ru/encyclopedia/zaytsegub-opyanyayushchiy, http://floruz.uz/content/lagochilus
pubescens-vved. http://www.niscair.res.in / Science Communication / Abstracting Journals.
61
institutions of the world, including the Department of Pharmacy Practice,
Southwestern Oklahoma State University, (USA), University of Mansoura (Egypt),
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (China), the Russian
Institute of Medicinal and Aromatic Plants (Russia), Institute of Chemistry of Plant
Compounds, and National University (Uzbekistan).
As a result of research carried out in the world on a search, isolation of
biologically active terpenoids from plants, determination of structure activity and
development effective hemostatics on their basis (Department of Pharmacy
Practice, Southwestern Oklahoma State University); studied hemostatic properties
of n-butyl-2-cyanoacrylate and used in oral and maxillofacial surgery, without
changing the level of anticoagulation (University of Mansoura, Egypt); The
chemical composition of plants
Lagochilus ilicifolius
, 10 compounds have been
isolated, identified by spectral analysis, of which three compounds were isolated
for the first time those were not previously found in the composition of plants in
the genus Lagochilus (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine);
investigations of triterpene saponins from licorice plant, creating molecular
complexes based on HA and its derivatives, and various flavonoids licorice plants
(VILAR) are being carried out; determination of physical and chemical, as well as
spectral properties of saponins and flavonoids from licorice root, standardization of
raw materials and preparations are also engaged (Samara State Medical
University).
In the world for the search, isolation of biologically active terpenoids from
plants, determination of structure activity and development of effective
hemostatics on their basis on a number of priorities are conducted studies,
including synthesis and determination of biological activities of labdane
diterpenoids structure activity study to find new potential bioactive natural
compounds; the study of the rheological properties of biologically active complex
compounds; study the mechanisms of action of hemostatic agents.
The degree of knowledge of the problem.
Plants of genus Lagochilus has
long been famous for their valuable therapeutic properties and are among the most
well-known medicinal plants of the East. One of the most common species of the
genus
Lagochilus
is
Lagochilus inebrians
«Lagochilus intoxicating». It has been
established that it comprises a main active ingredient – lagochilin. However,
unsustainable use of wild stocks of Lagochilus led to the fact that currently the
plant included in the Red Book.
Search, study of structure and biological properties of di- and triterpenoids
extracted from plant and animal origins were carried out by foreign scientists such
as H.A. Scheraga, M. Khalili, A. Liwo, Y. Zhang, R.F. Murray, H.W. Harper, D.K.
Granner, P.A. Mayes and A.F.Gammerman.
In the CIS countries, studies related to the composition and biological activity of
lagochilin derivatives from the plants of the genus
Lagochilus inebrians
as a whole
are conducted by scientists S.P Botkin, I.P. Pavlov, and G.V. Lazurevskiy. The
school of G.A. Tolstikov as a head is actively working on the study of complex
compounds based on glycyrrhizinic acid and its salts, physical
62
and chemical characterization and mechanisms of action of the obtained
compounds.
Plant Lagohilus intoxicating subjected to thorough chemical analysis thanks
to the works of scientists I.E Akopov, A.S. Sadykov, T.P. Pulatova, M.I. Ikramov,
I.I.Ibragimov, T.R. Abduraxmanov, S. Auelbekov., M.M. Abramov, U.N
Zaynutdinov, D.N. Dalimov. It is shown that the leaves and flowers of the plant
Lagochilus
contain diterpenoid – lagochilin. Lagochilin content in above-ground
organs of the plant is distributed unevenly. Most of it is in the leaves (1.98%),
reproductive organs (0.84-1.87%) and the least in the stems (0.15% of the absolute
air-dry plant mass).
On the basis of lagochilin derivative, an effective domestic water-soluble
hemostatic drug «Lagoden», a sodium salt of lagochirzinic acid, has been
developed. Currently, hemostatic drugs are not produced in the Republic. The main
arsenal of hemostatic treatments are imported.
Relation of dissertation topic with the research works of research
institutions where the work was done.
The dissertation research has been carried
out within the framework of the plan of research works for applied projects of the
Institute of Bioorganic Chemistry in accordance with, the State scientific and
technical program. P-15.20 «Creation and development of intravenous hemostatic -
Lagovin from local herbs» (2003-2005), A-10-053 «Creation and development of
hemostatic drug, in the form of absorbable collagen film, having a topical effect»
(2006-2008), FA-A12-T175 «Development of technology of drug forms of an anti
inflammatory drug «GLAS», a topical haemostatic preparation «Glilagin» and an
haemostatic for intravenous administration (2009-2011), IFA 2012-6-4 «Mastering
of technology for obtaining of haemostatic – «Lagovin» for intravenous, clinical
trials and production of a pilot batch» (2012-2014), and FA-I11-TO11 «Mastering
of technology for the production of haemostatic – Glilagin and development of
technical conditions for obtaining of lagochilin» (2015-2016).
The aim of the study
is the synthesis of labdane diterpenoid derivatives,
supramolecular complexes on the basis of glycyrrhizic acid and its salts, low
molecular weight polymeric carrier, the study of physical and chemical properties
and the development of new hemostatics.
Research Tasks:
isolation and purification of diterpenoid lagochilin from the plant
Lagohilus
intoxicating, chemical modification and the study of physical and chemical
characteristics;
isolation and purification of glycyrrhizic acid (GA) from the plant
Glycyrrhiza Glabra
, the development of experimental-industrial regulations for
obtaining of monoammonium salt of glycyrrhizic acid (MASGA) of 80% purity
and the production of an experimental batch;
obtaining supramolecular complexes of lagochilin with GA and MASGA in
various ratios and the study of physicochemical and spectral characteristics,
rheological properties of aqueous solutions, depending on the ratio of forming
complex components to determine the nature of the forces of interaction between
the components in an aqueous medium;
63
study of hemostatic properties of the synthesized derivatives of lagochilin
and supramolecular complexes to reveal the dependence structure - activity,
structure - the ratio of the main components of supramolecular complexes and
transfer the most active ratios for the depth pharmacotoxicological studies;
determination by the methods of calculation chemistry the most probable
structures of the studied compounds (mathematical modeling of the structure of
Glilagin);
development of the projects of laboratory and experimental-industrial
regulations of the technology for obtaining of the hemostatic substance «Glilagin»
and hemostatic substance for intravenous use «Lagovin»;
standardization of hemostatic substances «Glilagin» and «Lagovin»,
development of a dosage form for oral administration (tablets) «Glilagin» and for
intravenous «Lagovin».
development of the projects of temporary pharmacopeia articles (TPA) for
the substances, dosage forms of hemostatics «Glilagin» and «Lagovin» and their
transfer to the Chief Directorate for quality control of medical drugs and medical
equipment Ministry of Health of Uzbekistan.
preparation of technical documentation for authorization and conducting of
clinical trials in hospitals of Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan as
original hemostatic agents.
The objects of research
are plants
Lagochilus Inebrians
and
Glycyrrhiza
Glabra
. Glycyrrhizic acid, lagochilin and its acetylic, benzylidenic and
isopropylidenic derivatives, N-polyvinylpyrrolidon, supramolecular complexes.
The subject of research
is the physicochemical, rheological properties,
biological activity and standardization of dosage forms of glycyrrhizic acid, its
salts, and the creation of hemostatic agents.
Methods of research
. In the thesis were used methods of extraction, high
performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) for the
isolation and purification of individual di- and triterpenoids; for the determination
of the chemical structures of the new compounds were applied physicochemical
methods of research, including UV, IR and NMR spectroscopy, quantum-chemical
calculation methods using Chem Office 9.0 software packages and Hyper Chem;
for the standardization were applied pharmacopeia methods of quality control of
medicines and biological methods.
The scientific novelty of the work is as follows:
New aromatic acetals of lagochilin have been synthesized and the influence
of catalysts on the yield of end product has been shown;
Hemostatic activity relationships of acetyl and isopropylidene derivatives of
lagochilin depending on the nature of substituents and the number of free hydroxyl
groups were determined.
received supramolecular complexes of glycyrrhizic acid and
monoammonium salt of glycyrrhizic acid with lagochilin;
the structure, stability and thermodynamic properties of supramolecular
complexes of glycyrrhizic acid and its salts with lagochilin in aqueous solutions
64
were studied. Substantial dependence on the ratio of the complex forming
components and the chemical structure of the guest molecule were determined;
proved inclusion of drug (guest molecules, in particular, molecules of lagochilin)
to a micelle, which typically takes place with an energy gain of enthalpy of
formation;
determined entropy of the system (self-organization of micellar structures)
depending on the structural and functional features of the guest molecule, which
has a stabilizing effect on the process of structuring of the micelles consisting of
glycyrrhizic acid molecules.
Practical results of the investigation.
Developed two new hemostatic drugs
and substances developed their drug formulations in the form of oral (tablets) and
intravenous (2 ml ampules of 0.15% solution) application. The pilot batches of the
substances of «Glilagin» and «Lagovin» have been implemented. The production
of experimental batches of dosage forms of «Tablets Glilagin-0,005g» and «0.15%
solution of Lagovin» have been organized. Permissions for the clinical trials of the
hemostatic Lagovin in the intravenous form (0.15% solution) and Glilagin (tablets)
have been obtained. Production of the intermediate technical product to produce
glycyrrhizic acid has been set.
The reliability of the obtained results
is confirmed by the fact that they are
obtained with the use of modern physicochemical methods of research.
Confirmation of the obtained results are proved by the experts evaluations, and by
practical implementation of the research results, discussion of the research results
at national and international conferences, and the publication of the research results
in peer-reviewed scientific publications and by obtaining patents.
The scientific and practical significance of the results of investigation.
The scientific significance of the results of investigation is that a number of
derivatives of lagochilin and glycyrrhizic acid have been isolated and studied, new
supramolecular complexes on their basis have been synthesized. The biological
activity of the lagochilin derivatives and the dependence of the activity on the
chemical structure have been studied. Their identification and structure elucidation
by the physicochemical and calculation methods. Studying the rheological
properties of the complex compounds found that micellar states of complex
compounds are stabilized by hydrophobic-hydrophobic interactions and hydrogen
bonds.
The practical significance of the work is that based on synthetic
supramolecular complexes effective domestic hemostatic agents «Glilagin» and
«Lagovin» have been developed ". Laboratory and industrial regulations and TPA
projects of the substances «Glilagin» and «Lagovin», «Tablets Glilagin-0,005 g»
and «Lagovin 0.15% solution» have been developed, which are used for industrial
production of hemostatic agents.
Implementation of the research results:
on the basis of the results obtained from scientific investigations on isolation
of biologically active terpenoids from plants, determination of structure activities
and development of effective hemostatics on their basis:
65
developed local hemostatic Lagovin for intravenous usage and received a
patent for the invention of the Republic of Uzbekistan on Intellectual Property
Agency (04.12.2013, № IAP 04806), which is used in the pharmaceutical industry
to create an effective domestic hemostatic in medicine. As a result of the
investigation the obtained hemostatic was used as the main component for creating
a drug for intravenous administration which is undergoing clinical trials. Bottling
the drug was performed on the base of «Uzhimfarm» joint-stock company (bottling
Act of 02.15.2016);
hemostatic collagen film on the basis of Glilagin, having hemostatic and
tissue regenerating activities have been created and received a patent for the
invention of the Republic of Uzbekistan on Intellectual Property Agency
(13.10.2015, № IAP 05109), which was used in surgical interventions of various
etiologies. As a result the investigation the developed local medicinal form was
used for the prevention of vascular and capillary bleeding;
Temporary Pharmacopeia article on glyceram preparation substance has
been developed and approved (18.10.2013. TPA 42 Uz 2369-2013). Clinical trials
of «Glyciram tablets 0.05 g» as an anti-inflammatory drug have been carried out.
The obtained preparation will enable to substitute imported drugs with the same
action in the Republic of Uzbekistan.
Approbation of the results of investigation
. The results of the
investigation were set out in the form of lectures and were presented on 7 national
and 5 international conferences, including 9th Pushchino School-Conference for
Young Scientists «Biology is the Science of XXI Century» (Pushchino city, 2005);
«6th International Symposium Chemistry of Natural Compounds» (Anqara, 2005);
in Materials of scientific-practical conference «Modern problems of biochemistry
and endocrinology» (Tashkent, 2006); Republican scientific-practical conference
«Actual problems of biology, ecology and soil science» (Tashkent, 2006);
International conference on «Actual Problems of Chemistry of Natural
Compounds» (Tashkent, 2009); All-Russian Conference on Organic Chemistry,
Russian Academy of Sciences Institute of Organic Chemistry (Moscow, 2009);
International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry,
Technology, Pharmacology, Medicine», (Saint-Petersburg, 2011); «International
Symposium Chemistry of Natural Compounds» (Urumqi, 2011); 6th All-Russian
Conference «Clinical Hemostasis and hemorheology in Cardiovascular Surgery»,
(Moscow, 2013); International conference «Actual problems of development of
Bioorganic Chemistry» (Tashkent, 2013);
Publication of the research results.
In total 40 papers have been published
on the thesis theme. Of these, 11 scientific papers, including 9 in national and 2 in
international journals recommended by the Higher Attestation Commission of the
Republic of Uzbekistan for the publication of basic scientific results of doctoral
theses, received 2 patents for invention, 2 industrial regulations and 1 TPA.
The structure and volume of the thesis.
Structure of the thesis consists of
introduction, seven chapters, conclusion, list of references, and appendixes. The
volume of the thesis is 182 pages.
66
THE MAIN CONTENT OF THE WORK
In the introduction
the urgency and relevance of the study, the purpose and
objectives of the study are described and is characterized by the object and the
subject, compliance of the research indicated by the priority areas of Science and
Technology of the Republic are shown, the scientific novelty and practical results
of the study are revealed, the scientific and practical significance of the results,
implementation of the results research, information on published works and the
thesis structure are given.
In the first chapter of the thesis titled «
The chemical composition of plants
of the genus Lagochilus
» an overview of published data on species of Lagochilus
plants, vegetation, and chemical composition are provided. Chemical modification
techniques and isolating the lagochilin are also described. Data on the plant
Licorice, licorice root, chemical composition, the main active principles of licorice
GA and its salts are also provided. Chemical transformation, the biological activity
of the derivatives of GA, structure. One chapter is devoted to the discussion of
various applications of hemostatics, briefly about the mechanisms of their action.
In the second chapter of the thesis titled «
About hemostasis system and
hemostatic preparations
» is given reference data about hemostasis system,
system failure, about hemostatic preparations and their mechanisms of action.
In the third chapter of the thesis ―
Material conditions and modern
research methods, biological activity
ǁ are given methods, materials, reagents
used during carrying out of dissertation work. Instruments and systems used for the
identification by the method of thin-layer chromatography.
In the forth chapter of dissertation ―
Isolation Lagoсhilin, GA and its salts,
synthesis derivatives of Lagochilina
ǁ is given investigation on isolation of
lagochilin diterpenoid from the plant Lagochilus Inebrians. There are enough data
in the literature about isolation of lagochilin based on followed extraction by ethyl
alcohol, dichloroethane and water. For the basis we have taken isolation method of
lagochilin with dichloroethane, primary basic treatment of plant, which was
improved. Improving of the method was in the usage of dichloroethane 13-14
times without regeneration, whereas 10 or 11 times were the optimum for the
usage. This saved electricity, amount of solvent, total time and the yield of end
technical product. Lagochilin is re-crystallized from the acetone and during re
crystallization from different solvents can be obtained two kinds of crystalls of
lagochilin, anhydrous and monohydrated forms. X-ray data was obtained in the
laboratory of physicochemical methods of analysis lead by professor Ibragimov
B.T.
Improvement of the method lies in the fact that dichloroethane was used 13-
14 times without regeneration and the most optimum was the use of the solvent
without regeneration of 10 or 11 times. Thus, there is an energy, the amount of
solvent, the total time of extraction and the yield of desired final product are saved.
Lagochilin is recrystallized in acetone and recrystallization in various solvents can
give two kinds of crystals of lagochilin: a) anhydrous and b) monohydrated forms.
X-ray diffraction data were obtained in the laboratory of physicochemical methods
67
of analysis led by Professor Ibragimov B.T. Monocrystal of lagochilin as a
monohydrate was obtained from mixtures of solvents: acetone: toluene: ethanol. A
single crystal structure was studied by
X-ray diffraction (XRD).
O
CH
2
OH
O
CH
2
OH CH
2
OH
CH
2
OH
+
СНО
O
HOH
2
C HO
R R 1 2
R
1
2
R
O
where R
1
and R
2
- ОН, -ОСН
3
, -ОС
2
Н
5
,-Вr. (II.1- II.8)
Scheme 1. The general scheme of the synthesis of the aromatic acetals of lagochilin
Table 1
Some physicochemical characteristics of 3,18-benzylidene-15,16-dioxy-9,13-epoxylabdans
№
Ar
Rf
Catalyst
Т
melt.
С
о
Yield %
2
OCH
3
0,73
Н
2
SO
4
(conc.)
-
55
3
H
3
CO
OCH
3
0,26
Н
2
SO
4
(conc.)
-
60
4
OH
0,50
СuSO
4
()
anhydrous
136-137
35
5
OH
HO
0,38
СuSO
4
(anhydrous)
138-139
27
6
OH
OCH
3
0,45
СuSO
4
(anhydrous)
150-151
25
7
OH
OC
2
H
5
0,41
СuSO
4
(anhydrous)
167-168
30
8
OH
Br
0,40
СuSO
4
(anhydrous)
173-174
36
* System: methanol: acetone (2: 1)
Syntheses on basis of lagochilin with aromatic aldehydes, logically changing
the structure have not been studied so far. It was therefore interesting to study the
reaction of lagochilin with a number of aromatic aldehydes and reveal the
conditions of synthesis of the main product. It was shown that the synthesis of the
aromatic acetals of lagochilin containing different alkoxy groups as substituents on
the aromatic ring of the feasibility of the use of concentrated H
2
SO
4
as catalyst but
when the substituents are OH groups – anhydrous copper sulfate.
68
All the obtained aromatic acetals of lagochilin were purified by column
chromatography. The structure of the synthesized compounds were confirmed by
IR and NMR spectra. Some physicochemical characteristics are shown in Table 1.
In the IR spectra of the synthesized compounds in the 3300-3400 cm
-1
ranges
a broad band fluctuations attributable to the stretching vibrations of hydroxyl
groups at positions of 15,16 of the molecules of lagochilin that participate in the
formation of inter- and intramolecular hydrogen bonds were detected, and the
valence vibrations of hydroxyl groups of phenolic compounds found in the vicinity
of 3200 cm
-1
(compounds 4-8).
In the
1
H-NMR spectra of 4-8 compounds there are singlet signals of protons
of methyl groups at C8 and C10vin the range of 0.80-0.90 ppm, and the signals of
protons of methyl group at C4 of the molecule of lagochilin in the range of 1 ppm.
In the range of 3,4-4 ppm the signals of protons of -OCH
2
groups at C15, C16 and
C18, and in the region of 5.5 ppm - Quaternary proton signals of CH group were
detected.
Next acetyl derivatives of lagochilin were synthesized. There are much data
in the literature about the synthesis of tetra acetyl derivative of lagochilin. But very
little is known about the synthesis of mono, di and three acetyl derivatives, they
were mostly isolated from plant sources. Therefore, the synthesis method of tetra
acetyl derivative and gradual hydrolysis of the product obtained as well as their
separation by column chromatography were investigated.
The efficacy and bioavailability of the majority of biologically active
substances is shown in the aquatic environment (human div consists of 60-75%
of the structured water), so it was important to highlight except isolation the
preparation of salts, derivatives of GA to find out the fundamental issues of
physicochemical characteristics of aqueous solutions of synthetic supramolecular
complexes. The results of these studies can serve as the main basis of high-tech
development of effective hemostatics having wide spectrum of action.
As above mentioned, in order to increase the bioavailability of a biologically
active substance different chemical methods are used: obtaining of the relevant
salts (if it does not affect the basic biological function of the substance); covalent
or non-covalent modification with accessible permitted in medical practice
polymeric transport agents; obtaining supramolecular complexes with low
molecular weight carriers (ligands) such as cyclodextrins, crown ethers, and in the
last decade, natural amphiphilic compounds, in particular the GA and its salts are
widely used. As a carrier for the production of new medicinal (transport) forms of
known drugs (non-steroidal anti-inflammatory agents, prostaglandins, uracils) and
other biologically active substances 18β - glycyrrhizic acid has been proposed. The
premise of this approach is the idea of the obligatory presence in the structure of a
complex forming agent both in hydrophilic (binding the primary drug) and
hydrophobic (responsible for transport) parts. Since our object is lagochilin and
synthesized by us isopropylidene, benzylidene and acetyl derivatives are poorly
soluble in water. Therefore, as a solubilizing agent, we selected GA and some of its
mono salts (ammonium, potassium, lithium).
69
Grinding of licorice root
Treatment with the solution of ammonia
Extraction
Filtration
Extract
Repeated extraction
Н
+
precipitation
Filtration - Drying - Packing
Scheme 2. The technological process of isolation of TGA from licorice root
Based on the above mentioned, in the beginning, we will discuss methods
for isolating GA purification technology, selection of synthesizing GA salts and
obtaining of supramolecular complexes with lagochilin. To the methods of
isolation of GA from licorice root are devoted many papers. The main essence of
those lies in the fact that in the initial stage of the process high quality extract is
obtained, and the process and condensation until the latter desired condition are
studied. A method of obtaining crude technical product of not thickened extract
was approbated by deposition with sulfuric acid to give technical GA (TGA) with
the yield of 9-11% and with the content of GA varying from 25% to 45%.
Some physicochemical characteristics of TGA are shown in Table 2.
Table 2
Some physicochemical characteristics of TGA
№
The name of indicators
Analysis data
1
Appearance
Amorphous - solid coarse powder
with dark brown colour
2
Taste
Sugary-sweet with a bitter taste
3
Quantitative content of GA in %
40,0±5,0 %
4
Moisture %
5,5±1,5
5
Common ash in %
11,4±0,7
For TGA jointly with «Agro Bio Kimyo» Ltd. developed «TC 19783536-02:
2013» TGA. 1.5 tons of TGA product were obtained by this technology in the
«Bahodir & K» privately owned company, which is specialized on processing of
licorice root in Beruni city of the Republic of Karakalpakstan.
Technological process of obtaining GA and its salts from TGA consists in
extraction of GA on acetone solvent, followed by precipitation in the form of its
tri-substituted salts and acid hydrolysis mono-substituted salts with a purity of 72-
70
75% are obtained. The obtained GA and its salts were characterized by
physicochemical and spectral data. Table 3 summarizes some of their
physicochemical characteristics.
Table 3
Some physicochemical constants of GA and its salts
№
Substance
Appearance
М.М.
Boiling
temp. ºС
R
f
/b/
D
0,5%
IR
сm
-1
UV
nm
32
GA
White powder
,
840
210-213
0.07(II)
0.14(V)
+48
1042.
1656.
2873.
2948.
251
33
MASGA+3Н
2
О
Pale yellow
powder
, 894
225-227 0.32 (VII)
0.06 (I)
+40
1042.
1655.
2948.
3239.
251
34
MPSGA
White powder
with light
yellow shade
,
878
280-284
0.30 (VII)
0.26(II)
0.12(VI)
+36 1043. 1657
2948.3404
254
35
MLSGA
White powder
,
878
250-253 0.30 (VII)
0.26(II)
+36 1037. 1664
2941. 3410
251
* System: I - ethanol: chloroform (1: 3), II - methanol: chloroform (1: 3), III - water: acetonitrile:
acetone (3: 4: 2), IV - ethanol: chloroform (1.5: 3), V - methanol: acetone (2: 1), VI - water:
acetonitrile: acetone (1: 1: 1).
The purity of GA and its salts have been evaluated by the method of HPLC
in isocratic mode using a diode array detector and UV detector. For this, a sample
of the product was dissolved in 1% acetic acid solution. A mobile phase consisted
of 35 volumes of acetonitrile, 0.5 volume of glacial acetic acid and 64.5 volumes
of bi-distillate water. The flow rate is set 0.75-1.0 ml/min; detection is performed
at 254 nm, analysis time 16-17 min.
Figure 1. The chromatogram of MASGA of 80-85%
РurityFrom this chromatogram it is evident that there are associated peaks
except the main peak. According to
1
H-NMR spectroscopy, the accompanying
substances are: peak corresponding to after the main peak has shown that it is
different in the chemical structure of the aglycone, relative to the GA, so it is
identified as 18
α
-H isomer of GA.
71
1. acetone
2. 10% КОН methanol
Technical glycyrrhizic acid
1. acetone
2. 10% LiOH methanol
1. acetone
2. 25% ammonia
Tripotassium salt of GA
Glacial acetic acid
Trilithium salt of GA Triammonium salt of GA
Glacial acetic acid
Monopotassium salt of GA 72-75% Monolithium salt of GA 72-75%
Monoammonium salt GA 72-75%
Recrystallization with 80% ethanol
Мonopotassium salt of GA 80-82%
Мonoammonium salt of GA 80-82%
Recrystallization with 80% ethanol
Моnolithium salt of GA 80-82%
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
1,5% Н
2
SO
4
Glycyrrhizic acid
72
Scheme 5. Technological scheme of isolation of GA and its salts from TGA
The remaining peaks are partially hydrolyzed derivatives of 18
α
- and 18β
glycyrrhizic acid and glycyrrhetic acid, respectively. The total sum of the peak area
is 17
±
2.5%. Further purification of the GA passes through its dissolution in
acetone and precipitation as tri-substituted salts and hydrolysis of the latter from
glacial acetic acid. After recrystallization, a product with a purity of 90-92% is
obtained..
Figure 2. Chromatogram of preparatively isolated 100% MASGA
Related substances similar in structure are very difficult to separate.
Therefore, a method for producing of 100% purity is achieved via preparative
column separation. A chromatogram of 100% MASGA is shown in Figure 2. The
100% pure GA is obtained by preparative column separation. 100% GC
chromatogram is shown in Figure 6The biological activities of obtained MASGA
with varying degrees of purity: 70-75%, 80-82%, 90-92% and 100% are almost
identical. During purification, loss of the product takes place, and the output
relative to the original end product is reduced up to 25-30%. Therefore, we used
the GA and its salts with a purity of 80-82%.
In the fifth chapter of the thesis "
Supramolecular complexes, physico
chemical and rheological properties
" our further research has been devoted to
the preparation of supramolecular complexes of GA and its salts with lagochilin in
various molar ratios, the study of their physicochemical and rheological properties.
complexes are from 84 to 93%.
From the data given in Table 4 it is shown that the yield of supramolecular
CH
2
OH
O
OH
COOH
H
H
O
O
C
O
OH
O
COOH
O
CH
2
OH
H
O
C
O
O
O
O
RO
HO
OH
HO HO
+
n
RO
HO
C
OH
O
HO HO
O
H
O
C
OH
O
O
O
HO
OH
O
OH
HO
OH
n
where R: H (5-7), H
4
N (8-10), K (11-13)
Scheme 6.
General scheme of obtaining the supramolecular complexes of lagochilin
with GA and its MASGA MSGA.
73
All the obtained compounds are the optically active dextrorotatory
complexes. In the UV spectrum of the obtained compounds absorption band with a
maximum at 251-254 nm in the medium water: alcohol (50:50) corresponding to
the p-p* transition of conjugated double connection with the C ring skeleton
aglycone moiety of GA and its salts are observed.
Table 4
Some physicochemical constants of Lagochilin complexes with GA, MASGA,
MPSGA.
№
Complexes
Appearance
М.М.
Boiling
temp.
ºС
R
f
/
α
/
D
0.5%
IR
сm
-1
UV
nm
Yield
%
36
L-GA 1:2
White powder
2036
173-17
5
0.74(
V)
+12
1044, 1082
1728, 2942
251
93.8
37
L-GA 1:4
White powder
3716
175-17
8
0.73(
V)
+16
1044, 1080
1730, 2945
251
92.5
38
L-GA 1:9
White powder
7916
180-18
3
0.73(
V)
+14
1044, 1081
1732, 2947
251
93.7
39
L-MASGA 1:2
Pale yellow
powder, 2144
197-20
0
0.72(
V)
+24
1042, 1660
2943, 3384
250
90.0
40
L-MASGA 1:4
Pale yellow
powder, 3932
202-20
4
0.72(
V)
+20
1042, 1662
2945, 3385
250
84.7
41
L-MASGA 1:9
Pale yellow
powder, 8402
205-20
7
0.71(
V)
+22
1042, 1663
2946, 3386
250
88.7
42
L-MASGA 1:2
Pale yellow
powder, 2112
215-51
7
0.18
(I)
0,1(I
I)
+24
1043, 1079
1655, 3410,
251
93.2
43
L-MASGA 1:4
Pale yellow
powder, 3868
220-22
2
0.17
(I)
0.1(
II)
+12
1079, 1658,
2945, 3417
251
94.1
44
L-MASGA 1:9
Pale yellow
powder, 8258
225-22
7
0.17
(I)
0.1(
II)
+16
1043, 1660,
1948,3430,
251
93.5
* System: I - ethanol: chloroform (1: 3), II - methanol: chloroform (1: 3), V - methanol: acetone
(2: 1)
In the IR spectra of the obtained compounds characteristic valence spectra
vibrations at 1670-1650 cm
-1
characteristic of the carbonyl groups with the
frequency shift of GA and its salts in the low-frequency region of 60-55 sm
-1
with
respect to the original components are observed. This indicates the fact that the
carbonyl groups of GA and its salts are involved in the formation of
supramolecular complexes with Lagochilin. The broadening signal of the valence
vibrations of hydroxyl groups of lagochilin and GA at 3430-3380 cm
-1
also
indicates the process of complex formation.
In the
1
H-NMR spectrum of the complex of GA:L in the ratio of (2:2) taken
in acetone: of D
2
O, the following resonance frequencies can be found. The signal
in the area of 0.5 ppm refers to the protons of C-CH
3
C17; doublet at 0.7-0.8 ppm
region refers to protons of CH-CH
3
in C4 and C10 of lagochilin molecule. Signal
at 1.0 ppm refers to protons of CH-CH
3
at C4 in GA molecules. The singlet signal
at 1.3 ppm refers to C-CH
3
protons at C20. Unsplitted signal at 1.2 ppm applies to
all protons of lagochilin molecule skeletons. The signal of protons in the 2.8-3.0
ppm refers to protons of methyl groups’ acetone+deuterated water (solvent). The
complex signal at 3.0-4.5 ppm refers to all protons of CH
2
O CHO available in
74
lagochilin molecules and glycyrrhizic acid. The singlet signal at 5.0-4.5 ppm refers
to the olefinic protons at C12.
To date, the mechanism of gel formation and solubilization of GA remains
largely unknown and little is described in the literature. Therefore, the
establishment of basic physicochemical properties of the hydrogels of low
molecular weight natural compounds in various states of aggregation and causes of
showing high biological activities of supramolecular complexes on the basis of the
GA is relevant.
This stage of work was carried out together with the scientists of the
Department of «Polymer Chemistry» of the Chemistry Faculty of the National
University of Uzbekistan (professors U.N. Musayev and M.G. Mukhamediev).
Processes of structure formation in the solutions can also be characterized by
studying their viscosity. If in the solutions the process of association of solutes
takes place, the viscosity of solutions are sharply rised. Therefore, in order to
identify the associativity of molecules of supramolecular complexes viscosity of
their aqueous solutions has been studied. From fig. 7-8, it is evident that an
aqueous solution of molecular complex of GA with lagochilin in a ratio of 2:1 has
a very high viscosity characteristic of the associated systems. At the same time
with increasing the temperature, the given viscosity of the solution is decreased.
This fact testifies the destruction of the associates. However, for an aqueous
solution of a molecular complex of GA with lagochilin (9:1) an increase in
temperature leads to an increase in viscosity.
In the case of an aqueous solution of the molecular complex of GA with
lagochilin at the ratio of 9:1 we observe a decrease in viscosity with increasing
temperature. Apparently, these changes are due to the different ratios of the
hydrophilic-hydrophobic interactions for different compositions.
η
уд
/С
5
η
уд
/С
4,5
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5 1
0,5 0
1
3
2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
С,%
a
4
3,5 3
2,5 2
1,5 1
0,5 0
2
3
1
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
С,%
b
Figure 4. Dependence of the given viscosity of the aqueous solution of the
molecular complex of GA with lagochilin 2:1 (a) of 9:1 (b) on the
concentration at T = 298K (1), T = 303K (2), and T = 308K (3).
By studying viscosity of aqueous solutions of MASGA, supramolecular
complexes of GA and its monoammonium salts with lagochilin found that
inclusion of the hydrophilic compounds into the complexes lead to reduction and
the hydrophobic compounds (lagochilin) lead to increase the viscosity of their
aqueous solutions compared to viscosity of aqueous solutions of MASGA. All
these data confirm that in the the stabilization of the supramolecular complexes of
75
lagochilin the hydrogen bonds and hydrophilic-hydrophobic interactions between
molecules of diterpenoid and hydrophilic portion of triterpenoid saponin play the
main role. We have studied the energy formation of supramolecular complexes of
lagochilin with GA in absolute medium by the method of mathematical modeling
calculation on «HyperChem» and «Chem-Draw» programs to confirm the obtained
results.
Figure 4. The annular state of Glilagin. Energy 787. kcal/mol
It was shown that hydrogen bonds have the lowest energy of Lagochilin 15
and 18 hydroxy groups with hydroxyls of carboxyl group GA. In spherical
molecule is seen that lagochilin is not in the same plane formed by the ring of GA
but outside the GA molecule. This is clearly seen in the form of a spherical
structure of a supramolecular complex.
Investigation of rheology of aqueous solutions of supramolecular complexes
has shown that the inclusion of hydrophobic organic compounds to the
supramolecular complexes of GA and its monoammonium salt leads to increase
and the hydrophilic organic compounds to the difficulty of micelle formation in
aqueous solutions. Therefore, most likely that the guest molecules are located
between the layers of GA and its salts that are in the micellar state.
Figure 5. The micellar state of Glilagin. Energy 304. kcal/mol
76
The study of the structure by the method of mathematical modeling in a
single layer model showed that such a state of supramolecular complexes of GA
with lagochilin much more stable and energetically profitable than in a ring shaped
state. As can be seen the energy formation of bonds in micellar states in the form
of a layer two times less than that of the annular type. Thus, quantum-chemical
calculation model state of supramolecular complexes of GA and its salts with
Lagochilin show a clear failure of the energy (unfavorable) the structure of
supramolecular complex of the annular type. We believe that the complex of
lagochilin itself between two molecules of GA is an intermediate in the transition
micelle formation of different structural types (spherical bilayer, ellipsoidal).
Determination of KKM of the aqueous solutions of the complexes of GA and its
salts with lagochilin and other substances has been shown that the KKM with the
molecular complex of MASGA with hydrophobic substance of lagochilin is lower
than that of MASGA. Consequently, the inclusion of lagochilin to a molecular
complex has a stabilizing effect on the process of structuring MASGA molecules.
In the sixth chapter of the thesis "
Definition of haemostatic activity of
supramolecular complexes
" cited data of hemostatic activities of lagochilin
derivatives, which are in chemical structure can be divided into 3 groups: I.
lagohilin and its isopropylidene and acetyl derivatives (II.1, II.10- II.24); II.
anhydrolagochilins (II.28 II.30); III. diterpenoid lactones (II.9, II.25- II.27) as well
as the well-known drug Lagoden (II.39) were studied.
Considering the data presented in Table 5, it can be seen that all the tested
compounds in this group have a greater or lesser extent of hemostatic activity.
Moreover, it should be noted that 0.5% solution of lagochilin in peach oil exhibits
67% activity compared to the reference drug. By substituting hydroxyl groups at
C
3
and at C
18
to isopropylidene in the molecule of lagochilin hemostatic activity
falls to 40% and further substitution of hydroxyl groups at C
15
and C
16
to
isopropylidene groups led to complete loss of hemostatic activity (Compound
II.11).
Anhydrolagochilin exhibits relatively weak hemostatic activity (57%), and
the substitution of hydroxyl groups at the C3 and C18 to isopropylidene groups
reduces the hemostatic activity to 33% (II.30). Substitution of the hydroxyl groups
at C13 and C18 in the molecule of lagochirzin to acetyl groups (comp. II.26- II.27),
do not change their special hemostatic activity (67%). Introduction of
isopropylidene group to the molecule of lagochirzin decreases its hemostatic
activity to 51% (II.25), but the opening of the lactone ring to form the
corresponding sodium salt of 3,16,18-trihydroxy-9,13-epoxylabdan-15-oic acid
leads to a sharp increase in the hemostatic activity 100% (II.31). Comparison of
hemostatic activities of lagochilin (II.1), anhydrolagochilin (II.28), and lagochirzin
(II.9) using water-alcohol solutions indicate that the greatest activity has lagochilin
67%, following by lagochirzin 60% and anhydrolagochilin 57%.
Thus, it was shown that the substitution of two or three hydroxyl groups in the
molecule of lagochilin to acetyl groups relatively not much affect the hemostatic
activity, only complete substitution of hydroxyl groups to acetyl groups leads to
77
reduction of the hemostatic activity. Introduction of isopropylidene groups
adversely affects the display of the hemostatic activity, possibly due to the
increased hydrophobicity of lagochilin molecule
1
20
9
OCH
2
OR
4 15
O O
O O
OCH
2
OH COONa
R
1
O
3 5
17
CH
2
OR
3
R
1
O
O
R
1
O
R
1
O
R
19
2
O
18
R
2
O
R
2
O
R
2
O
II.1, II.10- II.24 I.9, II.25-II.27 II.28- II.30 II.31 а
C
CH
3
CH
3
b
H
3
C CO
Table 5
Hemostatic activity of lagochilin and its derivatives
№
Substitution
Hemostatic Activity
R
1
R
2
R
3
R
4
%
seconds
II.1
H
H
H
H
67
130,0±12,6
II.10
а
Н
Н
40
157,0±14,8
II.11
а
а
0
268,1±14,8
II.12
а
b
b
33
163,7±13,5
II.13
а
b
Н
32
165,0±14,7
II.14
b
Н
Н
Н
83
115,0±11,4
II.15
Н
Н
Н
b
82
116,0±10,8
II.16
Н
Н
b
b
83
115,0±10,5
II.17
b
b
Н
Н
84
114,0±10,6
II.18
b
Н
Н
b
83
115,0±10,6
II.19
b
Н
b
Н
83
115,0±11,0
II.20
Н
b
b
Н
83
115,0±11,0
II.21
Н
b
b
b
81
117,0±10,6
II.22
b
b
Н
b
83
115,0±11,2
II.23
b
b
b
Н
81
117,0±10,5
II.24
b
b
b
b
17
211,0±18,0
II.9
Н
Н
-
-
60
148,0±13,5
II.25
а
а
-
51
179,0±16,5
II.26
Н
b
-
-
68
129,0±13,0
II.27
б
Н
-
-
67
130,0±13,0
II.28
Н
Н
-
-
57
141,0±13,7
II.29
b
b
-
-
66
131,0±12.6
II.30
а
-
-
33
140,0±13,0
II.31
Control
100
98,0±10,0
*Р
<
0.01 with respect to control
Further specific hemostatic activity of the obtained supramolecular
complexes of Lagochilin with GA and its salts was examined in order to identify
the most active ratio of interacting components in the corresponding
supramolecular complexes. Investigation of the hemostatic activity of the resulting
78
complex compounds and initial materials was carried out in the laboratory of
Pharmacology of the Institute Bioorganic Chemistry (IBOC) Uzbek Academy of
Sciences under supervision of Dr. Vypova N.L.
Table 6
Bleeding time in rats after 60 minutes after intraperitoneal administration of
supramolecular complexes. (M
±
m; n = 5)
№
Preparation
Bleeding time
sec.
%
Р
1
Control, mg/kg
360
±
20
100
-
32
GA:L; 2:1, mg/kg
160
±
13
45
<
0.01
33
MASGA:L; 2:1,
mg/kg
85
±
6
24
<
0.01
34
GA:L; 4:1, mg/kg
165
±
14
46
<
0.01
35
MASGA:L; 4:1, mg/kg
100
±
10
28
<
0.01
36
GA:L; 9:1, mg/kg
185
±
16
51
<
0.01
37
MASGA:L; 9:1, mg/kg
120
±
12
33
<
0.01
From the data shown in Table 5, the greatest effect was observed with the
introduction of supramolecular complexes of MASGA with lagochilin to 85
±
6
minutes on 24%, to 100
±
10 min 28% and to 120
±
12 min 33% - relative to the
control.
The ratio also plays an important role in the expression of hemostatic
activity. This is well illustrated on the example of MASGA with lagochilin 2:1
ratio the most, which is more active than the ratio of 4:1, which is recommended
for in-depth pharmacological research in order to create on its basis a local
haemostatic preparation which was named Glilagin. Next, we have developed the
project of TPA to the substance Glilagin, and conducted full pharmaco
toxicological and special studies on the investigation of hemostatic activity. Based
on the obtained results on the substance of Glilagin the composition of drug forms
(oral tablets at 0,005 g) of Glilagin is designed. All the required standard
investigations to create a project of temporary pharmacopoeia articles (TPA) were
carried out.
To stop parenchymatous bleedings, in many cases the use of oral dosage
forms (d/f) is not effective, due to longer time to achieve the desired hemostatic
action. In this connection, intravenous forms of drugs are used. Earlier in the
Republic, only water-soluble hemostatic drug for intravenous usage, Lagoden
(derivative of Lagochilin) was produced. But its method of obtaining was difficult,
requiring high costs, expensive solvents and catalysts, and consists of five steps of
synthesis with a low yield of the final product (10-12% of the original).
сн сн
2
n
O
сн
2
он
сн сн
2
n
O
сн
2
он
сн
2
он
N O
HO
+
сн
2
он
N O
H O
H O X
HO
Y
Scheme 7. Synthesis was carried out according to the following scheme
79
Therefore, a problem has been arisen about development of a water-soluble,
effective, inexpensive hemostatic on the basis of Lagochilin. Furthermore, the
technology for producing the drug substance should be simple, inexpensive and
non- combustible.
Table 7
Some physicochemical properties of PVP complexes with lagochilin
№
Complex
Melting
temp. ºС
Solubility
%
IR cm
-1
Yield %
38
PVP:L
5:1
95-96
100
not stable
1666 С=О, 2960
C-N 3436-3422
-OH
95-97
39
PVP:L
10:1
96-97
100
not stable
1661 С=О, 2951
C-N 3431-3426
-OH
94-96
40
PVP:L
15:1
98-100
100
1662 С=О, 2955
C-N 3435-3420
-OH
92-95
41
PVP:L
20:1
99-100
100
1667 С=О, 2958
C-N 3433-3428
-OH
91-94
It is known that many polymeric drug carriers allowed for use in medical
practice alter the physicochemical properties of the basic substance. In particular,
they increase their water solubility. One such material is polyvinylpyrrolidone
(PVP). The low molecular weight PVP in the form of a solution used as detoxicant
and is completely excreted from the div within 2-3 days. We have also used a
low molecular weight PVP with the MM 8000
±
2000 D. Synthesis was carried out
according to the following scheme. The obtained supramolecular complexes of
lagochilin with polyvinylpyrrolidone in the ratios 1:5, 1:10, 1:15 and 1:20 but the
more stable and more active ratio was 1:15.
The new complex conditionally named by us -
Lagovin (lago- from lagochilin and -vin- from vinylpyrrolidone), a supramolecular
complex of Lagochilin with PVP. Lagovin combined all the properties of
Lagochilin and PVP, having an integrated therapeutic effect, not inferior in its
hemostatic effectiveness as compare to Lagoden and Dicynonum. Furthermore,
obtaining of Lagovin is technologically simple and the yield is more than 90%.
Pharmaco-toxicological studies of the substance and the dosage form were carried
out in the laboratory of Pharmacology IBOC Uzbek Academy of Sciences, and
biochemical studies at the Department of Biochemistry, Faculty of Biology
National University of Uzbekistan (NUUz) led by prof. Dalimova S.N.
To determine the ability of Lagovin to stimulate the process of blood
coagulation, Lagovin solutions in concentrations of 0.1%, 0.5% and 1% were used.
Initially in
in vitro
experiments the effect of Lagovin to the blood and plasma
coagulation time we investigated. The data presented in Table 8.
80
