ЎСИМЛИК ВА ҲАЙВОНОТ ОЛАМИ ГЕНОФОНДИ ИНСТИТУТИ,
ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ УНИВЕРСИТЕТИ, ГЕНЕТИКА ВА
ЎСИМЛИКЛАР ЭКСПЕРИМЕНТАЛ БИОЛОГИЯСИ ИНСТИТУТИ
ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ
14.07.2016.В.15.01 РАҚАМЛИ ИЛМИЙ КЕНГАШ АСОСИДАГИ БИР
МАРТАЛИК ИЛМИЙ КЕНГАШ
ГЕНОМИКА ВА БИОИНФОРМАТИКА МАРКАЗИ
БУРИЕВ ЗАБАРДАСТ ТОЖИБАЕВИЧ
ҒЎЗАДА (
GOSSYPIUM
SPP
.
) ПАТОГЕНЛАРГА ЧИДАМЛИЛИКНИ
БЕЛГИЛОВЧИ
MIC-3
КЛАСТЕР ГЕНЛАР ОИЛАСИНИ КЛОНЛАШ,
ТАВСИФЛАШ ВА МОЛЕКУЛЯР ЭВОЛЮЦИЯСИНИ ЎРГАНИШ
ҲАМДА БУ ГЕНЛАРНИНГ ҒЎЗА БИОТЕХНОЛОГИЯСИДАГИ
АҲАМИЯТИ
03.00.14 – Геномика, протеомика ва биоинформатика
(биология фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИНИНГ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ– 2016
1
УДК 577.21: 633. 511
Докторлик диссертацияси автореферати мундарижаси
Оглавление автореферата докторской диссертации
Content of the abstract of doctoral dissertation
Буриев Забардаст Тожибаевич
Ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга чидамлиликни белгиловчи
MIC-3
кластер генлар оиласини клонлаш, тавсифлаш ва молекуляр эволюциясини
ўрганиш
ҳамда
бу
генларнинг
ғўза
биотехнологиясидаги
аҳамияти............................................................................................................. 3
Буриев Забардаст Тожибаевич
Клонирование, характеристика семейства генов
MIC-3,
определяющих
устойчивость к патогенам хлопчатника (
Gossypium
spp
.
) и изучение их
молекулярной эволюции, а также значение этих генов в биотехнологии... 25
Buriev Zabardast Tojibaevich
Cloning, characterization and investigation of molecular evolution of pathogen-
resistance cluster
MIC-3
gene family in cotton (
Gossypium
spp
.
) and its
significance for cotton biotechnology………………………………….. 47
Эълон қилинган ишлар рўйхати
Список опубликованных работ
List of published works………………………………………………………… 67
2
ЎСИМЛИК ВА ҲАЙВОНОТ ОЛАМИ ГЕНОФОНДИ ИНСТИТУТИ,
ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ УНИВЕРСИТЕТИ, ГЕНЕТИКА ВА
ЎСИМЛИКЛАР ЭКСПЕРИМЕНТАЛ БИОЛОГИЯСИ ИНСТИТУТИ
ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ
14.07.2016.В.15.01 РАҚАМЛИ ИЛМИЙ КЕНГАШ АСОСИДАГИ БИР
МАРТАЛИК ИЛМИЙ КЕНГАШ
ГЕНОМИКА ВА БИОИНФОРМАТИКА МАРКАЗИ
БУРИЕВ ЗАБАРДАСТ ТОЖИБАЕВИЧ
ҒЎЗАДА (
GOSSYPIUM
SPP
.
) ПАТОГЕНЛАРГА ЧИДАМЛИЛИКНИ
БЕЛГИЛОВЧИ
MIC-3
КЛАСТЕР ГЕНЛАР ОИЛАСИНИ КЛОНЛАШ,
ТАВСИФЛАШ ВА МОЛЕКУЛЯР ЭВОЛЮЦИЯСИНИ ЎРГАНИШ
ҲАМДА БУ ГЕНЛАРНИНГ ҒЎЗА БИОТЕХНОЛОГИЯСИДАГИ
АҲАМИЯТИ
03.00.14 – Геномика, протеомика ва биоинформатика
(биология фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИНИНГ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ– 2016
3
Докторлик диссертациясининг мавзуси Ўзбекистон Республикаси Вазирлар Маҳкамаси
ҳузуридаги Олий аттестация комиссиясининг №14.07.2016/В2016.3.В158 рақам билан
рўйҳатга олинган.
Докторлик диссертацияси Геномика ва биоинформатика марказида амалга оширилди.
Диссертация автореферати уч тилда (ўзбек, рус, инглиз) Илмий кенгаш веб-саҳифаси
(www.flora-fauna.uz) ҳамда «ZiyoNET» ахборот-таълим тармоғига (www.ziyonet.uz)
жойлаштирилган.
Илмий маслаҳатчи
:
Абдурахмонов Иброхим Юлчиевич
биология
фанлари доктори, профессор
Расмий оппонентлар: Мухамедов Рустам Султанович
биология фанлари доктори, профессор
Турдикулова Шахлохон Уткуровна
биология фанлари доктори
Ризаева София Мамедовна
биология фанлари доктори, профессор
Етакчи ташкилот: Микробиология институти
Диссертация ҳимояси Ўсимлик ва ҳайвонот олами генофонди институти, Ўзбекистон
Миллий университети, Генетика ва ўсимликлар экспериментал биологияси институти ҳузуридаги
14.07.2016.В.15.01 рақамли Илмий кенгаш асосидаги бир марталик Илмий кенгашнинг 2016 йил
«_____» _______________ куни соат ____ даги мажлисида бўлиб ўтади. (Манзил: 100053, Тошкент
шаҳри, Боғишамол кўчаси, 232-уй. Ўсимлик ва ҳайвонот олами генофонди институти мажлислар
зали. Тел.: (+99871) 289-04-65, факс (+99871) 262-79-38, е-mail: igppa@academy.uz.).
Докторлик диссертацияси билан Ўсимлик ва ҳайвонот олами генофонди институти
Ахборот-ресурс марказида танишиш мумкин (___рақами билан рўйхатга олинган). Манзил:
100053, Тошкент шаҳри, Боғишамол кўчаси, 232-уй, ЎҲОГИ. Тел.: (+99871) 289-04-65.
Диссертация автореферати 2016 йил «____» ________________куни
тарқатилди. (2016 йил «_____» __________________ даги _____ рақамли реестр
баѐнномаси)
К.Ш. Тожибаев
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш раиси, б.ф.д.
Б.А. Адилов
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш илмий котиби, б.ф.н., катта илмий ходим
Ш.Юнусхонов
Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий
кенгаш ҳузуридаги илмий семинар раиси, б.ф.д.,
профессор
4
КИРИШ (докторлик диссертациясининг аннотацияси)
Диссертация мавзусининг долзарблиги ва зарурати.
Бугунги кунда
глобаллашув жараѐни чуқурлашиб бораѐтгани туфайли жаҳон қишлоқ
хўжалигида биохавфсизликни таъминлаш ва уларни биотик зарарлардан
(фитопатогенлар, зараркунандалар каби) ҳимоя қилиш бўйича хавотирлар
кучайди. «Патоген организмларнинг зарари дунѐ қишлоқ хўжалигида 1,4
триллион долларга тенг деб баҳоланади. Бу глобал ялпи ички маҳсулотнинг
5% ни ташкил этади»
1
.
Мустақиллик йилларида мамлакатимизда қишлоқ хўжалиги экинлари
ҳосилдорлигини ошириш борасида кенг қамровли ишлар олиб борилмоқда ва
бугунги кунда қишлоқ хўжалиги ишлаб чиқариши республикамиз йиллик
иқтисодий даромадининг бир қисмини ташкил этмоқда. Бу борада
пахтачилик соҳасида ҳам ислоҳотлар олиб борилиб, мазкур йўналишда
амалга оширилган дастурий чора-тадбирлар асосида муайян натижаларга,
жумладан, ғўза майдонлари қисқартирилиб, ҳосилдорликни ўртача 3-4
центнерга оширишга эришилди.
Жаҳонда пахта етиштириш жараѐнида турли патогенлар, хусусан ғўза
вилт касаллиги (
Fusarium
ва
Verticillium)
ва ғўза илдизида шиш ҳосил
қилувчи нематода (
Meloidogyne incognita;
RKN) ҳосилдорликка катта зарар
келтирмоқда.
Нематодалар
дунѐдаги
ўсимликлар
ҳосилини
14%
йўқотилишига олиб келади ва бу тахминан 100 миллиард долларга тенг
демакдир. «АҚШда нематода билан боғлиқ ғўза ҳосилини йўқотилиши
охирги ўн йил давомида сезиларли даражада ортган ва бу тахминан 205
миллион долларни ташкил этади»
2
. Шу нуқтаи назардан, муаммонинг
долзарблиги патогенларга қарши курашиш, дунѐ ғўза тадқиқотининг муҳим
вазифаларидан бири бўлган ғўза касаллигини тарқалишига қарши замонавий
биотехнология воситаларини тадқиқ этиш ва ривожлантиришдир. Бунда
нематодага қарши курашишнинг генетик асосларини ўрганиш бўйича
тадқиқотларни амалга ошириш қуйидагича изоҳланади: ғўзада патогенларга
чидамлиликни берувчи генларни аниқлаш; уларнинг ғўза геномидаги
таркиби ва тузилишини асослаш; хромосомалардаги ўрнини аниқлаш;
патогенларга чидамли линиялар олишда замонавий биотехнологик ва
геномик воситаларини тадқиқ этиш.
Ўзбекистон Республикасининг 2000 йил 31 августдаги 116-II сон
«Қишлоқ хўжалиги экинларини заракунандалар, касалликлар ва бегона
ўтлардан ҳимоя қилиш тўғрисида» ги Қонуни, Ўзбекистон Республикаси
Вазирлар Маҳкамасининг 2004 йил 29 мартдаги 148-сон «Ўсимликларни
ҳимоя қилиш хизмати тузилмасини такомиллаштириш ва самарадорлигини
ошириш чора-тадбирлари тўғрисида» ги қарори ҳамда мазкур фаолиятга
тегишли бошқа меъѐрий-ҳуқуқий ҳужжатларда белгиланган вазифаларни
амалга оширишга ушбу диссертация тадқиқоти муайян даражада хизмат
қилади.
1
http
://www.fao.org/docrep/018/i3300e/i3300e.pdf.
2
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNematode.aspx
5
Тадқиқотнинг
республика
фан
ва
технологиялари
ривожланишининг устувор йўналишларига боғлиқлиги.
Мазкур тадқиқот
республика фан ва технологиялар ривожланишининг V. «Қишлоқ хўжалиги,
биотехнология, экология ва атроф-муҳит муҳофазаси» устувор йўналишига
мувофиқ бажарилган.
Диссертация мавзуси бўйича хорижий илмий-тадқиқотлар шарҳи.
Ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга чидамлиликнинг молекуляр-генетик
тадқиқотларига йўналтирилган илмий изланишлар жаҳоннинг етакчи илмий
марказлари ва олий таълим муассасалари, жумладан, Texas A&M University
(АҚШ), Mississippi State University (АҚШ), University of California (АҚШ),
University of Georgia (АҚШ), CSIRO Plant Industry (Австралия), United States
Department of Agriculture (АҚШ), Northeast Institute of Geography and
Agroecology (Хитой) ҳамда Геномика ва биоинформатика Марказида
(Ўзбекистон) олиб борилмоқда.
Ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга чидамлиликнинг молекуляр
генетик тадқиқотларига оид жаҳонда олиб борилган тадқиқотлар натижасида
қатор, жумладан қуйидаги илмий натижалар олинган: нематода ва вилт
касаллигининг ўзаро алоқадорлиги ва нематода-вилт комплексини ўта
хавфлилиги аниқланган ва бу касаллик билан боғлиқ бир нечта ДНК
маркерлари топилган (California University, АҚШ); микросателлит
маркерларни қўллаш орқали ўрта толали ғўзанинг 11- ва 14- хромосомасида
RKN га чидамлилик QTL лари хариталаштирилган (United States Department
of Agriculture, АҚШ); жуда кўплаб ДНК маркерларидан (SSR ва AFLP
маркерлари) фойдаланган ҳолда, 1221 F
2
авлоди ўсимликларини текшириш
орқали Mi-C11/Mi-C14 локуслари аниқланган (Georgia University, АҚШ).
Дунѐда ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга чидамлиликнинг
молекуляр-генетик тадқиқи бўйича қатор, жумладан қуйидаги устувор
йўналишларда тадқиқотлар олиб борилмоқда: патогенларга чидамлиликнинг
янги генларини аниқлаш; ДНК маркерлари ѐрдамида QTL хариталаш;
патогенларга чидамли генларни хромосомалардаги ўрнини аниқлаш;
патогенларга чидамли янги биотехнологик навларни олиш.
Муаммонинг ўрганилганлик даражаси.
Ўсимликларда энг кўп маълум
бўлган чидамлилик билан боғланган мултиген кластер генларни хорижий
олимлардан B.J.DeYoung et al.
3
аниқлаган; L.He et al.
4
томонидан
аллотетраплоид ғўзада генларнинг тавсифи ва генетик хариталаш NBS-LRR
чидамлилик оқсилларини кодлаши аниқланган; X.D.Zhang at al.
5
ва
3
DeYoung BJ, Innes RW. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense. Nat Immunol. 2006
Dec;7(12):1243-9.
4
He L., Du C., Covaleda L., Xu Z., Robinson F.A., Yu J.Z., Kohel R.J., Zhang H.B. Cloning, characterization, and
evolution of the NBS-LLR-encoding resistance gene analogue family in polyploid cotton (
G. hirsutum
L.) // Mol
Plant Microbe Interact. 2004. 17:1234-1241.
5
Zhang X.D., Callahan F.E., Jenkins J.N., Ma D-P., Karaca M., Saha S., Creech R.G. A novel root-specific gene,
MIC-3
with increased expression in nematode-resistant cotton (
G. hirsutum
L.) after root-knot nematode infection //
Biochim.Biophys.Acta. 2002. 1576:214-218.
6
F.E.Callahan at al.
6
томонидан ғўзанинг юқори экспрессияланувчи ноѐб
MIC-3
оқсили илдиз нематодасига чидамли ғўзанинг зарарланган тўқималарида
аниқланган; M.Wubben at al.
7
чидамлилик мотивлари ѐки «NBS-LRR like»
доменлари билан боғлиқ эмаслигини кўрсатиб берди ҳамда
MIC-3
гени
оиласининг дастлабки хусусиятларини ўсимлик ҳимояланаѐтган пайтда
аниқлади ва бу генлар бошқа маълум бўлган ҳимоя йўлларидан мустақил
эканлиги исботланди.
Ўзбекистонда Х.Холматов томонидан нематодаларга чидамли ўрта
толали «Ғолиб» нави генетик жиҳатдан ўрганилган. Ш.Эгамбердиев
томонидан
Fusarium
авлоди патогенларининг геномини молекуляр-генетик
усуллар билан комплекс идентификацияланган ҳамда маҳаллий ғўза
навларига нисбатан кўп учрайдиган патоген тур ва расаларнинг патогенлик
хусусиятлари ўрганилган. Аммо, ғўзада касалликка чидамлилик учун
MIC-3
генини кластерланган супергенлари маҳаллий ва халқаро даражада ҳам ҳали
тўлиқ ўрганилмаган. Ҳозирги кунда ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга
чидамлиликни белгиловчи
MIC-3
кластер генлар оиласини тавсифлаш ва
молекуляр эволюциясини ўрганиш ҳамда бу генларни ғўза биотехнологиясида
қўллаш долзарб илмий-амалий аҳамиятга эга.
Диссертация мавзусининг диссертация бажарилган илмий-тадқиқот
муассасаси илмий-тадқиқот ишлари билан боғлиқлиги.
Диссертация
тадқиқотлари Геномика ва биоинформатика маркази илмий-тадқиқот ишлари
режасининг Ф4-Т149 «Маркерларга асосланган селекцияни ривожлантириш
учун ғўза геномини тадқиқ этиш» (2007-2011 йй.), UZB2-3101-TA-09
«Гермоплазманинг илдиз-шиш нематода ва Фузариум вилт касалликлари
билан потенциал қаршилигини баҳолаш ва SNP асосидаги кандидат ген
маркерларини ишлаб чиқиш» (2009-2013 йй.) ва ФА-Ф10-Т92 «Ғўза генлари
учун тузилган синтетик RNAi дуплекслари асосидаги бинар генетик
векторлар ѐрдамида юқори сифатли трансген ғўза линиялари олиш» (2009-
2011 йй.) мавзуларидаги фундаментал, амалий ва халқаро лойиҳалар
доирасида бажарилган.
Тадқиқотнинг мақсади
MIC-3
генларини ғўза геномидаги таркиби,
тузилиши, хромосомалардаги ўрнини ҳамда аллотетраплоид ва уларнинг
аждодларига яқин бўлган диплоид геномлардаги дупликация механизмлари
ва молекуляр эволюцияланиш кўламини аниқлашдан иборат.
Тадқиқотнинг вазифалари:
Gossypium
турларидаги аллотетраплоид ва уларнинг аждодларига яқин
ҳисобланадиган диплоид ғўзалардаги
MIC-3
гени оилаларини клонлаш ва
секвенслаш;
Gossypium
турларидаги
MIC-3
генларини батафсил филогенетик таҳлил
қилиш ва классификациялаб, уларни субоилаларга ажратиш;
6
Callahan F.E. Zhang X-D., Ma D-P., Jenkins J.N., Hayes R.W., Tucker M.L. Comparison of
MIC-3
protein
accumulation in response to root-knot nematode infection in cotton lines displaying a range of resistance levels // J
Cotton Sci. – USA, 2004. 8:186-190.
7
Wubben M.J., Callahan F.E., Hayes R.W., Jenkins J.N. Molecular characterization and temporal expression analyses
indicate that the
MIC
(
Meloidogyne-induced cotton
) gene family represents a novel group of root-specific
defense-related genes in upland cotton (
G. hirsutum
L.) // Planta. 2008. 228:111-123.
7
ғўза геномидаги
MIC-3
генлари кетма-кетликларида тахминий
гаплотипларни аниқлаш ва
MIC-3
ген аъзоларининг хромосомаларда кластер
ҳолатида жойлашувини тасдиқлаш учун келажакдаги маркерларга асосланган
селекция дастурлари учун фойдали бўлган SNP маркерларини ишлаб чиқиш;
MIC-3
генларини тахминий оқсил кетма-кетликларини ва нуклеотидлар
алмашинуви тезликларини тавсифлаш билан
MIC-
3 генларини ғўза геномини
полиплоидизацияга учрашидан олдин ва кейинги молекуляр эволюцияланиш
тезлиги, генларни дупликацияси, геномда сақланиб қолиш механизмларини
ўрганиш;
MIC-3
генлари маълумотларига асосланиб, ғўза геном эволюциясини
ўрганиш, ҳамда
Gossypium
авлодидаги геномлар дивергенцияланиши
вақтларини қайта баҳолаш;
MIC-3
генлари нуклеотидларини «синоним» ва «носиноним»
алмашинуви тезлигига асосланиб, нематода ва бошқа касалликларга
чидамлиликни белгилайдиган адаптив селекция жараѐнини ўрганиш;
MIC-3
генлари экспрессиясини
Fusarium
ва
Verticillium
вилти билан
зарарланиш жараѐнида чидамли ва чидамсиз ғўза генотипларини қиѐсий
ўрганиш;
MIC-3
генлари орасидаги спейсер кетма-кетликларни аниқлаш ва шу
асосида ўзида минимал промотор регионлари тутган бинар генетик векторлар
тузиш ҳамда уларни модел ўсимлик
Arabidopsis
га трансформация қилиш
орқали келажакда ғўза ва ўсимликлар биотехнологияси учун фойдали
промотор кетма-кетликларни аниқлаш;
ўсимлик генлари, хусусан
MIC-3
генлари функцияларини ўрганиш учун
ўзида РНК дуплекслари тутувчи ўсимлик генларининг бинар векторлари
асосларини тузиш ва оптималлаштириш.
Тадқиқот объекти.
Ўсимлик материали сифатида қўш гаплоидли
G.
barbadense
Pima 3-79 ([AD]
2
-геном),
G. tomentosum
([AD]
3
-геном),
G.
mustelinum
([AD]
4
-геном) ҳамда
G. hirsutum
([AD]
1
-геном) нинг тўққизта
генотипи, шу жумладан Clevewilt, M240, M315, Ғолиб, ST213, M8, Техас
Маркер-1 (TM-1) линия ва навлари, таъсирчан изолиния (Sisoline)лар ва қизил
мутант линия (REDM)лардан фойдаланилган. Ундан ташқари, тадқиқот
жараѐнига киритилган учта диплоид турлардан аввалдан мавжуд бўлган AD
тетраплоид турларининг A
t
(А-субгеноми) ва D
t
(D-субгеноми) геномларига
жуда яқин бўлган
G. herbaceum
(A
1
-геном) ва
G. Raimondii
(D
5
-геном) ҳамда
F-геномли Африка ѐввойи тури
G. longicalyx
ишлатилган.
MIC-3
генларининг
хромосомаларда жойлашувини аниқлаш учун полиморфизмларни скрининг
қилиш йўли билан моносомик ва монотелиодисомик линияларда
G. hirsutum
x
G. barbadense
интер специфик F
1
дурагайлари ва уларга ўхшаш бўлган
бирламчи моносомик
G. hirsutum
x
G. mustelinum
лар каби F
1
дурагайларида
делецияларни аниқлаш тестидан фойдаланилди.
Тадқиқот предмети
15 та тетраплоид ва диплоид ғўза генотипларида
аниқланган касалликларга чидамлиликни бошқарадиган ноѐб
MIC-3
генлари
ҳисобланади.
8
Тадқиқотнинг усуллари.
Диссертацияда молекуляр биологиянинг
асосий усуллари (ДНК ажратиш, генларни секвенслаш ва клонлаш), генетик
тузилмаларни таҳлил қилиш, филогенетик кластерлаш, ген конверцияси ва
рекомбинацияси, молекуляр эволюция дивергенцияси вақти, молекуляр
маркерлар ва бинар вектор конструкцияларини ишлаб чиқиш, генетик
трансформация ҳамда биоинформатика ва статистик таҳлилнинг замонавий
усулларидан фойдаланилган.
Тадқиқотнинг илмий янгилиги
қуйидагилардан иборат
:
биринчи марта ғўзанинг 15 та аллотетраплоид ва диплоид геномларидан
MIC-3
суперген оиласига мансуб 169 та индивидуал ген аъзолари клонланган,
секвенс қилинган ва тавсифланган;
ушбу 169 та
MIC-3
ген аъзолари таҳлили асосида 15 та ғўза
генотипларида 4 тадан 16 тагача ген аъзолари мавжудлиги ва улар 2-10 тагача
субоилаларга бўлиниши аниқланган. Барча
Gossypium
турларида 169 та
MIC-3
генлари кетма-кетликлари филогенетик жиҳатдан умумий миқдорда 17
та геномларга хос бўлган субоилаларга ажратилган;
аллотетраплоид геномларида аниқланган
MIC-3
генларининг таҳлили
асосида A
t
ва D
t
геномларга хос бўлган 42 та гаплотип кетма-кетликлари
исботланган.
MIC-3
генларига хос SNP маркерлари яратилган ҳамда гаплотип
ва субоила гуруҳлари асосида A
t
геномда 9 та тахминий
MIC-3
локуслари ва
D
t
геномда 3 та тахминий локуслар аниқланган;
биринчи марта геномларга хос бўлган
MIC-3
генларидан олинган махсус
SNP маркерлар яратилган ва
MIC-3
генлари ғўзанинг 4- ва 19-гомелогик
хромосомаларида кластер ҳолида жойлашганлиги аниқланган;
биринчи марта ғўзанинг 15 та тетраплоид ва диплоид генотипларида
MIC-3
генларининг нуклеотидлар алмашинуви тезлиги ва молекуляр
эволюция жараѐнлари аниқланган;
MIC-3
генларини кодловчи ДНК кетма-кетликларидаги синоним (K
s
) ва
носиноним (K
a
) нуклеотидларни ўртача сонини баҳолаш асосида
«ҳамкорликдаги» бошланғич эволюция амалга ошганлигига қарамай
MIC-3
генлари «туғилиш ва ўлим» эволюцион модели остида 1-экзонда тозаловчи
ва 2-экзонда дивергенция селекцияси таъсирида эволюцияланиб борганлиги
аниқланган;
илк бор «генларни амплификацияланиши»
MIC-3
генларининг барча
дупликацияланган нусхаларини сақланиб қолишини таъминловчи механизм
сифатида эканлиги ва ғўзани ҳимояланиш жараѐнида генларнинг янги
функцияларини «шарпали ўлжа» модели остида пайдо бўлиши аниқланган;
ҳар хил геномларда
MIC-3
генларининг дупликацияси турли тезликларда
содир бўлиши исботланган. Аллотетраплоид геномларда ҳар ~1 миллион
йилда, A/F-геномларда ҳар ~2 миллион йилда ва D геномларда ҳар ~8
миллион йилда битта дупликация содир бўлиши аниқланган;
MIC-3
генларининг экспрессияси таҳлилига кўра
Fusarium
ва
Verticillium
вилтига чидамли генотипларида бу генларнинг фаол эканлиги аниқланган;
биринчи марта ўзида
MIC-3
гени илдиз-специфик промоторини тутган 2,5 кб
узунликдаги регионнинг генлараро спейсер кетма-кетликлари
9
клонланган, секвенсланган ва тавсифланган.
Тадқиқотнинг амалий натижалари
қуйидагилардан иборат:
MIC-3
гени ДНК даги кетма-кетликлари тавсифланган ва натижалар замонавий ғўза
селекцияси, биотехнологияси бўйича амалий дастурларида вилт ва
нематодага чидамлиликни оширишда фойдаланиш учун илмий асос сифатида
тавсия этилади;
MIC-3
гени учун SNP маркерлар яратилган ва улардан тўғридан-тўғри
ғўзанинг маркерларга асосланган селекциясида (МАС) янги навлар яратишда
фойдаланиш учун тавсия этилади;
MIC-3
промоторлари кетма-кетлиги остидаги
GUS
маркер генидан
иборат бир нечта бинар векторлар тузилган ҳамда модел
Arabidopsis
ўсимлигига трансформация қилинган. Ўсимликлар биотехнологияси учун ўта
фойдали бўлган илдиз тўқимасидагина ишлайдиган
MIC-3
генининг минимал
промотори тавсия этилади;
ўсимликлар биотехнологияси учун генлар фаоллигини ўрганишда
фойдаланиладиган синтетик RNAi вектор конструкциялари яратилган ва ғўза
биотехнологиясида янги линиялар олинган.
Тадқиқот натижаларининг ишончлилиги
замонавий усул ва
ѐндашувлар ѐрдамида тасдиқланган. Маълумотлар вариациялар таҳлили
(ANOVA), молекуляр вариациялар таҳлили (AMOVA), Wilcoxon таҳлили
ҳамда замонавий секвенс таҳлил алгоритмлари (Sequencher, ClustalX, Mega
4.1, BLASTX), филогенетик таҳлил усули (UPGMA, Mega 4.1, NJ), ген
конверсия ва рекомбинацион тест (GeneConv, DNASP, RDP3, SiScan) ва
алмашиниш даражаси (KaKs билан Juke-Cantor тузатишлари; кодонга
асосланган Z-тестлар) таҳлили каби классик статистик усуллардан
фойдаланиб, қайта ишланган, таҳлил қилинган ва тасдиқланган. Ғўза
геномида “синоним” нуклеотидларини йиллар давомида ўзгариб бориши
r=Ks/2T формуласи ѐрдамида ҳисобланган.
Тадқиқот натижаларининг илмий ва амалий аҳамияти.
Тадқиқот
натижаларининг илмий аҳамияти биринчи марта молекуляр эволюция ва
селектив кучлар, шунингдек диплоид ва тетраплоид ғўза турларида илк бор
таърифланган «ген амплификацияси»
MIC-3
генлари дупликацияланган
нусхаларининг сақланиб қолиши аниқланганлиги, «bait and switch» (шарпали
ҳўрак) модели остида ўсимликнинг ҳимоявий фаолияти давомида янги ген
функцияларини юзага келтирувчи механизмларнинг таърифланганлиги
ҳақидаги янги билим ва тушунчалар билан изоҳланади.
Тадқиқот натижаларининг амалий аҳамияти ғўзада касалликка нисбатан
юқори чидамлиликни таъминловчи, ижобий селекциялар асосида шаклланган
MIC-3
генларидан олинган SNP маркерлари ғўзанинг вилт ва нематодаларга
чидамли навларини яратишда замонавий МАС дастурларида қўлланилиши,
бундан ташқари, ўсимликлар биотехнологиясида
MIC-3
ген промоторидан
ҳар қандай ген функцияларини ғўза ва бошқа ўсимликларнинг илдиз қисмига
қайта йўналтиришда, трансген ҳолатларнинг хавфсизлигини таъминлашда
самарали фойдаланилиши, генлар фаоллигини ўрганишда қўлланиладиган
синтетик RNAi вектор конструкцияларини яратилганлиги билан изоҳланади.
10
Тадқиқот натижаларининг жорий қилиниши.
MIC-3
кластер генлар
оиласини тавсифлаш ва молекуляр эволюциясини ўрганиш ҳамда уларни ғўза
биотехнологиясида қўллаш доирасида олинган натижалар асосида:
ўсимлик хужайраларида ген экспрессиясини сусайтирувчи кичик
интерференция берувчи РНК (siRNA) усули учун Ўзбекистон Республикаси
Интеллектуал мулк агентлигининг ихтиро патентлари (12.01.2011, № IAP
04300; 02.06.2011, № IAP 04383; 23.05.2011, № IAP 04360; 23.05.2011, № IAP
04361) олинган. Илмий тадқиқот натижалари ўсимликлар биотехнологиясида
генлар,
жумладан
MIC-3
генлари
фаоллигини
аниқлаш,
вектор
конструкциялар трансформацияси орқали янги линиялар олиш имконини
берган;
MIC-3
кластер генлари АҚШ қишлоқ хўжалиги Департаменти
томонидан
молиялаштирилган
№6064-21000-014-00-D
«Маркерларга
асосланган ва анъанавий селекция ѐрдамида ғўзани генетик яхшилаш ва
генларни
Gossypium
нинг экзотик турлари орасидан гибридлаш» лойиҳаси
доирасида фойдаланилган (2013-2018 йй.) (АҚШ Қишлоқ хўжалиги
департаментининг 2016 йил 26 сентябрдаги маълумотомаси).
MIC-3
кластер
генларидан фойдаланган ҳолда нематодаларга чидамли линияларни олиш
ҳамда ғўзанинг патогенларга чидамлилигини янада ошириш имконияти
яратилган.
Тадқиқот натижаларининг апробацияси.
Тадқиқот натижалари 13 та
илмий-амалий анжуманларда, жумладан, «Conference of American Society of
Agronomy» (New York, 2006), «Ўсимликлар молекуляр биологиясининг
долзарб муаммолари» (Тошкент, 2008), «Ғўзанинг дунѐ генетик хилма
хиллиги асосий ва амалий лойиҳалар асосида» (Тошкент, 2010), «Биология –
наука XXI века» (Пущино, 2010), «Актуальные проблемы развития
биоорганической химии» (Ташкент, 2010), «International Cotton Genome
Initiative сonference» (Canberra, 2010), «5
th
World cotton Research Conference»
(Mumbai, 2011), «International Cotton Genome Initiative (ICGI) conference»
(Brasilia, 2006; Raleigh, 2012), «International Cotton conference» (Bremen, 2014),
«Генетика, геномика ва биотехнологиянинг замонавий муаммолари»
(Тошкент, 2016) мавзуларидаги республика ва халқаро илмий-амалий
конференцияларда маъруза кўринишида баѐн этилган ҳамда апробациядан
ўтказилган.
Тадқиқот натижаларининг эълон қилиниши.
Диссертация мавзуси
бўйича жами 28 та илмий иш чоп этилган, шулардан Ўзбекистон
Республикаси Олий Аттестация комиссиясининг докторлик диссертациялари
асосий илмий натижаларини чоп этиш тавсия этилган илмий нашрларда 10 та
мақола, жумладан, 5 таси республика ва 5 таси хорижий журналларда нашр
этилган ҳамда тадқиқотда қўлланилган усуллар билан боғлиқ 4 та республика
патенти олинган.
Диссертациянинг тузилиши ва ҳажми.
Диссертация таркиби кириш,
бешта боб, хулоса, фойдаланилган адабиѐтлар рўйхати ва иловалардан
иборат. Диссертациянинг ҳажми 171 бетни ташкил этади.
11
ДИССЕРТАЦИЯНИНГ АСОСИЙ МАЗМУНИ
Кириш
қисмида
амалга
оширилган
илмий-тадқиқотларнинг
долзарблиги ва зарурати асосланган, тадқиқотнинг мақсади ва вазифалари,
объект ва предметлари тавсифланган, республика фан ва технологиялари
ривожланишининг
устувор
йўналишларига
мослиги
кўрсатилган,
тадқиқотнинг илмий янгилиги ва амалий натижалари баѐн қилинган, олинган
натижаларнинг илмий ва амалий аҳамияти очиб берилган, тадқиқот
натижаларини амалиѐтга татбиқ этиш ҳамда нашр этилган ишлар ва
диссертация тузилиши бўйича маълумотлар келтирилган.
Диссертациянинг
«Чидамлик
генлари
ва
чидамликлар
геномикасининг ютуқлари»
деб номланган биринчи бобида ғўза бўйича
олиб борилган молекуляр-генетик тадқиқотлар келтириб ўтилган.
Ўсимликларда чидамлик генларининг тавсифи, молекуляр-эволюцияси
ва ўсимликлар биотехнологиясида қўлланилиши ҳақидаги маълумотлар,
ушбу йўналишдаги асосий муаммолар ва уларни ҳал этишдаги имкониятлар
санаб ўтилган.
Диссертациянинг «
Ғўзанинг кластер генларини ўрганишдаги
материал, шароит ва услублар
» деб номланган иккинчи боби
тадқиқотларда фойдаланилган усулларга бағишланади.
Бунда ўсимлик материаллари ва фойдаланилган реагентлар, ДНК
ажратиш усуллари, клонлаш, ДНК кетма-кетликларини ўқиш (секвенс) ва
уларни
замонавий
статистика
усуллари
ѐрдамида
филогенетика,
гаплотиплаш, ген конверцияси, рекомбинация ва молекуляр эволюция
асосида олиб борилган таҳлил натижалари бўйича батафсил маълумот
келтирилган.
Диссертациянинг «
Gossypium
турининг
MIC-3
генларини тавсифлаш
ва хромосома бўйича жойлашуви
» деб номланган учинчи бобида
MIC-3
ген
оиласининг жойлашган ўрни, структураси ва таркиби ўрганилиб, клонланган,
секвенс қилинган, ҳамда аллотетраплоид ва диплоид ғўза геномларида
тавсифланган.
Тадқиқотлар қуйидаги натижаларни ўз ичига олади:
MIC-3
гени учун 15 та ғўза генотипининг ҳар биридан ПЗР ѐрдамида
олинган тахминан 150 та индивидуал клонлар инсерцияси секвенс қилинди.
Gossypium
турининг
MIC-3
гени ампликонлари 653-713 н.ж. оралиғида бўлиб,
барча аллотетраплоид генотипларида ампликонлар 653-706 н.ж.,
G. herbaceum
турида 703-713 н.ж.,
G. raimondii
турида 653-691 н.ж. ва
G. longicalyx
турида 706 н.ж. узунликларни ташкил қилган (1-жадвал). Барча
ўрганилган
Gossypium
турлари учун кўплаб ДНК кетма-кетликларининг
ўзаро қиѐсий таҳлиллари асосида
MIC-3
генининг 721 н.ж. узунлигидаги
тўлиқ консенсус кетма-кетлиги тузилди.
Gossypium
туридаги
MIC-3
генининг
интрон ва экзон қисмлари
MIC-3
генининг нуклеотид ва оқсил кетма
кетликлари асосида аннотация қилинди (Zhang ва бошқ., 2002).
12
1-жадвал
Gossypium
туридаги
MIC-
3 ген оиласининг тавсифи
Генотип
Аъзол
ар
Ампликон
узунликлари
Инсерция-делецияли
ўзгаришлар
Умумий
SNP лар
сони
вариацияси
экзон 1 интрон 3' UTR
Gh_TM1
10
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Sisoline
11
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_ST213
11
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_M8
12
697 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
17 (A
t
),
20 (D
t
)
Gh_REDM
13
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Golib
16
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
15
-
21 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_Clevewilt
13
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M240
9
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M315
15
653 (D
t
)
697 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
-
-
18 (A
t
),
27 (D
t
)
Gb_3-79
11
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
15
11 (A
t
),
29 (D
t
)
G. tomentosum
9
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
10 (A
t
),
24 (D
t
)
G. mustelinum
15
653 (D
t
)
668 (A
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9*
9
-
-
-
-
-
15,29
29
15
-
12 (A
t
),
28 (D
t
)
G. herbaceum
9
703
707
709
713
-
-
-
-
12
8
6
8
6
6
6
-
19 (A)
G. raimondii
4
651
653
691
9
9
-
-
-
-
31
29
-
33 (D)
G. longicalyx
11
706
-
-
- 14 (F)
*
Эътибор беринг
:
G. mustelinum MIC-3
генининг специфик ампликони A
t
-геномнинг
биринчи экзонидаги 9 н.ж. узунликдаги индели триплетга эга бўлиб, у бошқа
генотипларда кузатилаган D
t
-геноми учун специфик бўлган инделларга нисбатан юқорида
жойлашган; Gh –
G. hirsutum
; Gb –
G. barbadense
.
Тадқиқотларда барча
Gossypium
турларидан кўплаб геном кетма
кетликларининг ўзаро қиѐсий таҳлилларига кўра қуйидагилар, яъни
MIC-3
генининг оқсил кодламайдиган 5’ UTR регионида 11 н.ж. узунлигига, икки
13
оқсил кодловчи регионларида 221-230 н.ж. (экзон 1) ва 193 н.ж. (экзон 2),
ягона оқсил кодламайдиган интрон регионида 65-77 н.ж. ва оқсил
кодламайдиган 3’ UTR регионида 151-195 н.ж. узунлигига мувофиқ келгани
аниқланди.
Йирик инсерция-делеция (indel) ўзгаришлари туфайли вариациялар
содир бўлган, булар ўрганилган ғўза генотипидаги
MIC-3
ген оиласининг
баъзи аъзоларида кузатилган. Масалан,
G. herbaceum
туридан (А-геном)
ташқари ўрганилган барча ғўза геотипларининг биринчи экзонида D геноми
учун специфик 9 н.ж. узунлигидаги индел мавжудлиги аниқланди.
Аҳамиятлиси шуки,
G. mustelinum
At-геномига хос бўлган кодон
триплетларини юқори йўналишида (upstream) силжитувчи 9 н.ж. узунликдаги
индел топилди (1-жадвал).
Шунингдек,
G. hirsutum
М8 линиядан ташқари барча аллотетраплоид
авлодларининг 3’UTR регионида 15 н.ж. ва 29 н.ж. узунлигидан иборат икки
йирик индел мавжудлиги аниқланди. Бунда 29 н.ж. узунлигидаги индел
(структура ва жойлашиши аниқланган) аллотетраплоидларнинг таҳминий
D-геном аждоди ҳисобланган
G. raimondii
турига ҳам тегишлидир. 15 н.ж.
узунлигидан иборат инделлар ноѐб бўлиб, улар фақатгина аллотетраплоид
генотипларида аниқланди, аммо улар диплоидларнинг тахминий аждоди
ҳисобланган A ва D геномларда мутлақо учрамади. Ғўзанинг AD геномидаги
(1-жадвал)
MIC-3
ампликонларининг 3’UTR регионида учрайдиган индел
намуналари ўрганилиб, 15 н.ж. ва 29 н.ж. узунликдаги индел
комбинацияларидан иборат янада мураккаб ампликонлари
G. mustelinum
(3 та
турли типлари),
G. barbadense
Pima 3-79 линияси (икки типда) ва
G. hirsutum
туркимининг Ғолиб навларида (икки типи) аниқланди. Ушбу жараѐнда
G.
barbadense
Pima 3-79 линияси ва
G. hirsutum
туркумининг Ғолиб навларидаги
MIC-3
индел намуналари фақат 15 н.ж. узунликдаги ампликон инделлари
ўхшаш бўлиб, бу
G. barbadense
ва Ғолиб нави ўртасидаги ўзаро
дурагайланиш содир бўлганлигидан далолат беради. Бошқа томондан,
G.
hirsutum
турининг М8 линияси барча ген клонидан ҳар қандай
MIC-3
ген
аъзосининг 3’UTR регионида 15 н.ж. ѐки 29 н.ж.узунликдаги инделлар
топилмади. М8 линиясидан фақатгина 12 та
MIC-3
ген аъзолари аниқланган.
Wubben ва бошқ. (2008) томонидан олиб борилган изланишларда ғўзанинг
айнан М8 генотипидаги 15 та турли ген аьзолари тўғрисида баѐн этилган.
Бунга бизнинг ПЗР ѐрдамида амалга оширилган клонлаш тажрибаларида
баъзи
MIC-3
гени аъзоларининг амплификацияланмай қолгани сабаб бўлиши
мумкин.
Филограммада генларнинг 169 та аьзолари 17 та турли субоилаларга
ажратилганлиги кўрсатилди (1-расм).
G. hirsutum
генотипидаги 110 та ген
аъзолари 12 та субоилаларга ажратилди, булардан 1-9 гача бўлган субоилалар
A
t
-геномга, 10-12 гача бўлгани эса D
t
-геномга хос бўлган. 13- ва
14-субоилалар
G. herbaceum
, 15- субоила
G. longicalyx
, 16- ва 17- субоилалар
G. raimondii MIC-3
гени оиласи учун хос бўлганлиги аниқланди.
G.
mustelinum MIC-3
генининг биргина аъзоси (
MIC-3
_14) дан ташқари барча
14
1-расм.
Gossypium
туркумининг 86 та турли
MIC-3
генлари асосида
тузилган «яқин қўшниларнинг бирлашуви» усулидаги эгри филогенетик
шажараси:
Бутстреп қийматлари (>50%) кўрсатилган.
15
аллотетраплоид ген аъзолари
G. hirsutum
12-оиласига киритилди (1-расм).
Бироқ,
MIC-3
_14 А-геномда топилган 13-субоилага киритилди. AD геномли
ғўзаларнинг тахминий аждодлари ҳисобланган
G. herbaceum
(A-геном) ва
G.
raimondii
(D-геном) икки турли субоилага эга бўлган. Баъзи турлар учун хос
бўлган субоилаларнинг мавжудлиги ҳам кузатилди. Масалан, 1-субоила
касалликка чидамсиз изолиниялар ҳисобланган (S-изолиния) ST213 ва
Clevewilt билан биргаликда фақатгина
G. hirsutum
турида аниқланди,
8-субоила эса М315-линиянинг, ҳамда 11-субоила М8 ва М315 ўрта толали
ғўза линияларининг нуклеотид кетма-кетлигидан иборат эканлиги кузатилди.
Тетраплоид ғўзада
MIC-3
генларининг гаплотипларини аниқлаш учун
G.hirsutum
асосида тузилган
MIC-3
генларининг «қўшниларнинг бирлашуви»
(Neigbour Joining) филограммасидан фойдаланилди. Чунки бу тур линияларда
турли гуруҳларнинг кенг қамровли вакиллари мавжуд.
G. hirsutum
(AD)
гаплотиплари тахминий икки йирик – 1) A
t
-геном ва 2) D
t
-геном
гаплотиплари гуруҳига ажратилди. Бу гуруҳлаш диплоид ғўзаларнинг
тахминий аждодлари бўлган
G. herbaceum
ва
G. raimondii
кластеризациясига
асосан амалга оширилди.
G. herbaceum
ва
G. raimondii
консенсус кетма
кетликларидан гаплотиплар жадвалида референс кетма-кетлик сифатида
фойдаланилди (диссертацияга қаранг).
G. hirsutum MIC-3
генлари
субоилаларининг классификациясига (юқорида келтирилган) мувофиқ
равишда натижалар шуни кўрсатдики,
G. hirsutum
туркумининг А
t
-геномида
ўртача 3,5 аллел ѐки гаплотип/локус бўлган 9 та, D
t
-геномида эса ўртача 3,3
тахминий аллел ѐки гаплотип/локус бўлган 3 та тахминий локуслардан
(гаплотип гуруҳлар) иборатлиги аниқланди. Тахминий локуслардаги
гаплотиплар ѐки таҳминий аллелларнинг сони А
t
-геномда 2 дан 6 гача ва
Dt-геномда 4 дан 6 гача бўлганлиги аниқланди. Тетраплоид
MIC-3
ген кетма
кетликларининг А
t
-геномида 25 та SNP ва D
t
-геномида 26 та SNP лардан
ташкил топганлиги, уларнинг 113 (A, D), 162 (D) ва 568 (D) жойлашувларидан
ташқари барчаси биаллел эканлиги маълум бўлди.
Ҳар бир SNP учун нуклеотид жуфтлигининг ўртача миқдори А
t
-геномда
182,6 н.ж ва D
t
-геномда 108,8 н.ж. узунлигига тенг. TM-1 (
G. hirsutum
учун
стандарт линия) ва Pima 3-79 (
G. barbadense
учун қўш гаплоидли стандарт
линия) ғўза линияларида
MIC-3
генларининг алоҳида филогенетикаси
(1-расм) ва уларнинг секвенс таҳлилларига асосланиб, ушбу икки ғўза тури
ўртасида полиморфизмларни аниқлашда муҳим бўлган GSP (геном специфик
праймерлари) маркерлари дизайн қилинди. Кейинчалик ушбу кандидат ген
маркерлари делеция таҳлили учун ишлатилди. Бу эса моносомик,
монотелодисомик, CS-B ва NTN гибридларни ўз ичига олган цитогенетик
коллекцияни скрининг қилиш орқали амалга оширилди (Stelly ва бошқ.,
2005; Goutirez ва бошқ., 2009). Ҳар иккала ота-она турлари ўртасидаги
полиморфизмлар деярли барча F
1
дурагайларда намоѐн бўлди. Бироқ, TM-1
ғўза линияси A
t
-геномидан ажратиб олинган
MIC-3
генларининг 8 та турли
аъзоларидан 7 тасига хос бўлган барча 8 та GSP аллеллари 4-хромосома (H04
моносомик) ѐки унинг калта елкаси (Te04Lo монотелодисомик) бўйича
моносомик бўлган гипоанеуплоид F
1
ўсимликларда (
G. hirsutum
) учрамади.
16
2-расм.
G. hirsutum
(TM-1),
G. barbadense
(Pima 3-79) ва AD геномли
ғўзаларнинг икки тахминий диплоид аждодларининг
MIC-3
генлари
асосида тузилган «яқин қўшниларнинг бирлашуви
»
усулидаги эгри
филогенетик шажараси:
Шох узунликлари, бутстреп қийматлари (>50%), хромосомада жойлашуви ва геномнинг
келиб чиқиши кўрсатилган, соддалаштириш мақсадида улар ранглар билан ажратилган.
Шунингдек,
ушбу
маркерларнинг
барчаси
4-хромосомаси
алмаштирилган CS-B04 линияда ҳам
G. hirsutum MIC-3
аллелларининг
йўқлигини кўрсатди. Булардан фарқли равишда, барча 8 та GSP локуслари
бошқа бир нечта хромосомаси алмаштирилган линиялар ва 4-хромосоманинг
узун елкаси йўқ (нуқсонли) монотелодисомик F
1
ўсимликда (Te04sh)
гетерозигота ҳолатда бўлганлиги аниқланди.
Тўпланган натижалар TM-1 линиясининг 8 та A
t
-геном
MIC-3
аъзоларидан 7 таси 4-хромосоманинг калта елкасида жойлашганлигини
кўрсатиб, ғўза геномида
MIC-3
генларининг кластерли жойлашувидан
17
далолат беради (2-расм). Гарчи, TM-1 ва Pima 3-79 линиялари ўртасидаги
D
t
-геном
MIC-3
гаплотипга хос бўлган турли GSP маркерлари аниқланган
бўлсада, улар делеция таҳлиллари, ҳамда хромосомал локализация
тажрибаларида полиморф эмаслигини кўрсатди. 3-79
MIC-3
аъзоларида ўзаро
бир-бирини қопловчи сайтларнинг мавжудлиги, цитогенетик линияларда GSP
полиморфизмларни фарқлашни қийинлаштирди. Аммо,
G. mustelinum
линияси
MIC-3
аъзоларининг батафсил секвенс таҳлиллари икки турдаги GSP
праймерларини (TM-1 ва Pima 3-79 ўртасида полиформик бўлмаган)
тузишимиз учун ѐрдам берди. Ушбу праймерлар делеция таҳлилида
генотипга хос бўлган аллелларни аниқловчи бўлиб, TM-1 ва
G. mustelinum
MIC-3
ген аъзолари ўртасида полиморфизмга эга. Учламчи моносомик F
1
турлараро NTN 12-19 ва NTN 10-19 гибридларида TM-1 аллели турлича
етишмаган. Ушбу ТМ-1 аллели SNP маркерига хос, аммо
G. mustelinum
аллелига мос эмас. NTN 12-19 ва NTN 10-19 ўсимликларида TM-1 линиясига
хос бўлган 12- ва 19- ҳамда 10- ва 19-хромосомаларнинг узун ѐки калта
елкалари нуқсонли бўлиб, уларда ушбу хромосомаларнинг тегишли қисмлари
мавжуд эмас. Булар биргаликда, TM-1 линияси D
t
-геном
MIC-3
аъзоларидан
бирининг (
MIC
_3_10) 19-хромосомадаги чегарасини аниқлаб беради. Бироқ,
10- ва 12-хромосомалари нуқсонли бўлган биринчи авлод турлараро
моносомик дурагайлари (H10 ва H12) соғлом F
1
дурагай каби GSP
MIC-3
маркерларининг TM-1 ва
G. mustelinum
аллеларига эга бўлганлиги
аниқланди.
Натижалар
D
t
-геномдан
олинган
MIC-3
гени
аъзоси
ушбу
хромосомаларда эмас, балки 19-хромосомада жойлашганлигини кўрсатди.
Шунингдек, яна бир қатор бошқа хромосомалари бўйича нуқсонли бўлган
гипо-анеуплоид F
1
ўсимликлари ҳам соғлом F
1
дурагай каби SNP
маркерларининг TM-1 ва 3-79 линияларидан ўтган аллелларига эга
бўлганлиги маълум бўлди.
G. hirsutum
ғўза турида ҳозирча 19-хромосоманинг
дастлабки моносомик линияси йўқлиги боис натижалар ушбу D
t
-геном
MIC-3
аъзосининг
G. hirsutum
ғўза тури 19-хромосомасида жойлашганлигини аниқ
билиш имконини бермайди.
MIC-3
генлари экспрессиясининг таҳлиллари вилт патогени билан
зарарланган ва зарарланмаган бир қанча ғўза генотипларида олиб борилди.
Бунда
MIC-3
генлари
Fusarium
ва
Verticillium
билан зарарланган тўқималарда
юқори даражада оверэкспрессиялангани аниқланди. Оверэкспрессия чидамли
генотипларда сезиларли даражада юқори бўлгани аниқланди. Ушбу
маълумотлар
MIC-3
генларининг нафақат илдизда шиш ҳосил қилувчи (галл
нематодаси) (RKN) нематода касаллигида, балки касалликка алоқадор бўлган
оқсил (PR-protein) каби ғўзанинг вилт касаллиги ва бошқа касалликлардан
ҳимояланишида муҳим роль ўйнаши кўрсатиб берилди.
Диссертациянинг
«Gossypium
турларида
MIC-3
ген оиласининг
молекуляр эволюцияси
» деб номланган тўртинчи бобида 15 тетраплоид ва
диплоид ғўза генотипларида нуклеотид алмашинуви тезлиги ва
MIC-3
мультиген оиласининг молекуляр эволюцияси намуналари тўғрисида
маълумот берилган.
18
Тадқиқотлар қуйидаги натижаларни ўз ичига олади:
Барча 169 та
MIC-3
ген аъзоларининг интрон ва UTR секвенс
регионларини олиб ташланиши натижасида
MIC-3
ген аъзолари учун
характерли бўлган ва уларни кодловчи 131 та ДНК секвенси 15 та ғўза
генотипларидан топилди, ҳамда улар кейинчалик тахминий оқсил кодловчи
кДНК секвенслари алоҳида 56 та гуруҳларга ажратилди. Ушбу кодловчи ДНК
кетма-кетликлари кўп бора ClustalX дастури ѐрдамида 423 н.ж. узунлигига
муваффақиятли тенглаштирилди, бу дастур
MIC-3
генларининг бутун
кодловчи регионларини, шу жумладан биринчи (231 н.ж.) ва иккинчи (192
н.ж.) экзонларни қамраб олади. Бу 56 та ўзига хос тахминий кДНК
кетма-кетликлари, барча 15 ғўза генотипларида назарда тутилган 29 хил
махсус оқсил кетма-кетликларини ҳосил қилди. Умумий олганда,
Gossypium
туркумининг тахминий
MIC-3
оқсил кетма-кетликлардаги аминокислоталар
фарқи 141 аминокислота позицияларидан (30%) 42 позициясида аниқланди.
A
t
-геномдан олинган оқсил гуруҳларига нисбатан D
t
-геномдан олинган
тахминий
MIC-3
оқсилларида кўплаб аминокислота ўзгаришлари рўй берган.
Аминокислоталар ўзгариши таҳминий
MIC-3
оқсилларининг A
1
- ва F-геном
гуруҳларида нисбатан камроқ кузатилган. Бундан фарқли ўлароқ, энг кўп
сонли аминокислота ўзгаришлари D
5
- геномли
MIC-3
генларининг барча 4
тахминий оқсилларида кузатилди.
Шунингдек,
MIC-3
генлари оиласининг молекуляр эволюцияси
Gossypium
генотипларининг 15 та тетраплоид ва диплоид вариациясига
асосланиб ўрганилди, булар биргаликда филогенетик жиҳатдан турли етти
геномларни ифодалайди ва улардан кўпинча эволюцион тадқиқотларда
фойдаланилади.
Синоним
(d
S
) ва носиноним (d
N
) нуклеотидлар
алмашинувининг тезлиги
MIC-3
генларининг ҳар иккинчи экзони ижобий
танлов босими остида эканлигини тахмин қилишга имкон беради, бу
вақтнинг ўзида функцияларни сақлаш учун биринчи экзон кучли изоляцион
танлов босими остида бўлади (2-жадвал). Нуклеотидлар алмашинуви
коэффицентларига асосланиб, биз қуйидаги хулосага келдик, яъни кучли
изоляцион танлов остида 1-ва 2-экзонда дивергент танловда
MIC-3
генлари
«туғилиш ва ўлим» жараѐни ѐрдамида эволюцияга учрайди (2-жадвал).
Олинган натижаларга кўра, «ген амплификацияси» механизми
MIC-3
генларининг икки ҳисса ортган барча нусхаларини
Gossypium
геномларида
сақлаш учун ѐрдам беради, бу ўз навбатида R-ген эволюциясининг «шарпали
ўлжа» моделига айнан мутаносибдир.
Маълумотлар
MIC-3
генларининг дупликацияси турли тезликларда
содир бўлганини кўрсатади, аллотетраплоидларда ~1 миллион йилда бир
марта, A/F геном тўпламида ~2 миллион йилда бир марта ва D геном
тўпламида ~8 миллион йилда бир марта (3-расм).
MIC-3
генлари оиласидаги
ўзгаришлар функционал турғунликни (1-экзонда изоляцион танлов орқали)
ошириш мақсадида гўѐки эволюцион танловни акс эттиради, шу билан бир
вақтда турли зараркунанда ва патогенларга жавоб бериш мақсадидаги янги
«ўзгартирувчи» (2-экзонда дивергент танлов орқали) ишланмалар учун
имкониятларни кенгайтиради. Бундай эволюцион роллар гипотезага мувофиқ
19
2-жадвал
Ғўзанинг
MIC-3
ген оиласи учун нуклеотид алмашинувининг генотип
ичидаги ўртача кўрсаткичлари
Генотиплар
Геном
A
t
D
t
Умумий*
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
Gh_TM-1
[AD]
1
0.80 2.19 0.37 4.19 4.33 0.97 1.85 2.57 0.72
Gh_Sisoline
[AD]
1
0.69 1.94 0.36 4.19 4.33 0.97 1.56 2.34 0.66
Gh_M315
[AD]
1
0.67 1.89 0.35 2.86 3.49 0.82 1.57 2.38 0.66
Gh_M8
[AD]
1
0.78 1.94 0.40 3.53 3.23
1.09
1.36 2.14 0.64
Gh_Clevewilt
[AD]
1
0.80 1.89 0.42 2.79 2.86 0.98 1.61 2.16 0.74
Gh_Golib
[AD]
1
0.66 2.24 0.30 4.19 4.33 0.97 1.50 2.55 0.59
Gh_M240
[AD]
1
0.76 2.09 0.36 4.19 4.33 0.97 1.67 2.46 0.68
Gh_ST213
[AD]
1
0.58 2.04 0.28 4.19 4.33 0.97 1.37 2.48 0.55
Gh_REDM
[AD]
1
0.97 1.97 0.49 4.04 3.74
1.08
1.51 2.37 0.64
Gb_Pima 3-79
[AD]
2
0.31 1.04 0.30 2.84 2.76
1.03
1.90 1.87
1.02
G. mustelinum
[AD]
4
0.39 0.79 0.49 2.30 2.11
1.09
1.73 1.34
1.29
G. tomentosum
[AD]
3
0.49 0.83 0.60 2.90 2.84
1.02
1.78 1.62
1.10
G. herbaceum
A
1
-
-
-
-
-
-
0.43 0.41
1.05
G. raimondii
D
5
-
-
-
-
-
-
3.70 2.83
1.31
G. longicalyx
F
-
-
-
-
-
-
0.35 2.37 0.15
Хамма
G. hirsutum
[AD]
1
2.06 0.61 0.30 2.79 2.37 0.85 1.32 2.39 0.55
Хамма
Gossypium
турлари
-
1.90 0.58 0.31 2.57 2.20 0.86 1.80 2.58 0.70
Эслатма:
Gh –
G.hirsutum
; Gb –
G.barbadense;
Sisoline – чидамсиз изолиния; *Умумий A
t
ва D
t
комбинацияси; d
S
– синоним нуклеотидлар алмашинуви тезлиги; d
N
– носиноним
нуклеотидлар алмашинуви тезлиги; d
N
:d
S
– носиноним алмашинувнинг синоним алмашинуви
кўрсаткичига бўлган нисбати, икки кетма-кетликнинг бир-биридан ажралишидан бошлаб, яъни
бу тахминан d
N
:d
S
билан баробар, носиноним алмашинувларнинг синоним алмашинувларга
бўлган сонлар нисбати; қалин ҳарфларда 1 кўрсатилганга нисбатан d
N
:d
S
қийматлари юқорироқ;
d
N
ва d
S
қийматлари 100
x
га кўпайтирилган.
ҳисобланади, яъни ушбу ноѐб чидамлилик генлари оиласи аъзолари
томонидан
Gossypium
туркумида зараркунанда ва патогенларга қарши
курашда мослашувчан афзалликлари билан таъминланади.
Диссертациянинг
«MIC-3
генлараро регионларидан илдиз специфик
промоторларни молекуляр тавсифлаш ва илдиз учун специфик
экспрессияни амалга ошириш мақсадида илдиз специфик промотор
билан генетик конструкциялар яратиш
»
деб номланган бешинчи бобида
ғўза биотехнологияси келажаги учун фойдали бўлган, илдиз учун хос,
минимал узунликдаги
MIC-3
гени промотерининг нуклеотид кетма
кетликлари ҳамда синтетик РНК дуплекслар ѐрдамида вектор конструкцияси
яратилган.
Тадқиқотлар қуйидаги натижаларни ўз ичига олади:
20
3-расм.
Gossypium
диплоид ва аллотетраплоид турларининг
MIC-3
гени
оиласида ген дупликацияси намунаси:
(A) диплоид турлар: Gherb –
G. herbaceum;
Glong –
G. longicalyx;
Grai –
G. raimondii
; (B) –
аллотетраплоид турлар: Gh_TM1 –
G. hirsutum
TM-1, GB-379 –
G. barbadense
Pima 3-79;
Gmust –
G. mustelinum
, ва Gtom –
G. tomentosum
.
Эслатма:
ушбу изланишларда
фойдаланилган бошқа
G. hirsutum
генотиплари (Sisoline, M315, Clevewilt, M240, ST213,
Golib, M8 ва REDM) ҳам худди шундай ген дупликацияси намунасига эга, улар бу ерда
келтирилмаган. Дивергенция вақти баҳолари (MYA)
MIC-3
аъзоларининг жуфтликлардаги
синоним алмашинувлари тезлиги коэффицентини ҳар бир генотип/турлар учун 2,6
x
10-9
синоним алмашинувларни сайт/йил нисбатидан фойдаланиб ҳисобланган.
MIC-3
гени кластерларининг 2,5 kb генлараро регионлари амплификация
қилинди, клонланди ва
MIC-3
генларининг биринчи экзон қисмидан тузилган
праймерлар жуфтлиги ѐрдамида нуклеотидлар кетма-кетлиги аниқланди.
Кўплаб нуклеотидлар кетма-кетлиги алайнментлари (қиѐсламалари) учун
220-240 н.ж. (тўғри) ва 130-154 н.ж. (тескари) консенсус позициясидан
фойдаланилди. Ушбу генлараро
MIC-3
гени кетма-кетлиги таҳлилларининг
натижасида TATA-боксда промотор кетма-кетлиги хусусиятларини, ҳамда
патоген ва илдизга хос кўплаб турли мотивлар кетма-кетлигини
идентификациялаш имконини берди. Ушбу 2,5 kb промотор кетма
кетлигининг турли фрагментларини амплификация қилиш учун бир нечта
праймер жуфтликлари тузилди.
Бу минимал промотор регионларини аниқлаш учун имкон яратди.
Тузилган праймер жуфтликларининг охирида фермент рестрикцион сайтлари
мавжуд бўлиб, улар
GUS
репортер генини ўзида тутган бинар плазмида
векторига киритиш учун муҳим ҳисобланади. Бизнинг тадқиқотимизда
MIC-3
генининг 2562 н.ж. промотор фрагменти Hind III ва BamHI рестрикцион сайт
адаптерларини ўзида тутган праймерлар жуфтлиги билан қайта
21
амплификация қилинди. 5'-терминал делецияларининг турли узунликдаги
қисқартирилган промотор фрагментлари ҳар бирига хос праймерлар
жуфтлиги ѐрдамида бир хил тарзда амплификация қилинди (4-расм). Ушбу
промотор фрагментлари оммавий фойдаланилиши мумкин бўлган pBI101
векторига киритилди, бу
GUS
генини кодловчи регионнинг юқори қисмида
жойлашган. Натижада pBI101-MIC3_Pr::GUS серияли бинар векторлари
асосида қуйидагилар тузилди: P-2500 (- 2500/-1, 2500 н.ж.), P-2200 (- 2200/-1,
2200 н.ж.), P-1800 (-1882/-1, 1882 н.ж.), P-1600 (-1658/-1, 1658 н.ж.), P-1300
(-1381/-1, 1381 н.ж.), P-1000 (- 1057/-1, 1057 н.ж.), P-700 (-708/-1, 708 н.ж.).
4-расм.
MIC-3
промотори функциясини тасдиқлаш:
A –
MIC-3
гени промоторининг фрагментларга ажратилган нуклеотид кетма-кетлиги
[1,9-Marker λ/Hind III, 2 Pr-2500, 3 Pr-2200, 4 Pr-1882, 5 Pr-1381, 6 Pr-1057, 7 Pr-708, 8
Pr-1658]; B ва С –
GUS
маркер генини ўзида тутган pBI101 бинар векторига субклонлаш.
P-700::GUS ни экспрессияловчи трансген арабидопсис ўсимликларида
GUS
экспрессияси
намунасини гистокимѐвий бўяш; (D) – 1 ҳафталик трансформация қилинган ниҳолча; (E) –
назорат арабидопсис ўсимлиги.
Векторлар
Agrobacterium tumefaciens
бактерияларининг LBA4404 штамми
(ғўза трансформацияси учун) ѐки GV3101 штаммига (арабидопсис
трансформацияси учун) киритилди, ҳамда арабидопсис ўсимлигида
in planta
трансформация тажрибалари ўтказилди. Бу
MIC-3
промоторининг 708 н.ж.
узунлигидаги минимал региони ҳар қандай ген экспрессияни ўсимликнинг
илдиз қисмига йўналтириш учун етарли бўлишидан дарак беради. Векторсиз
трансформация тўпламлари билан биргаликда, ушбу
MIC-3
вектор тўплами
Coker-312 ғўза навининг жами 1383 дона гипокотил кесмаларига
трансформация қилинган. Векторсиз тўплам сифатида, яъни салбий назорат
22
учун 125 дона гипокотил кесмалари сув билан ишлов берилди. Соматик
регенерация усулида
GUS
маркер генини бошқарувчи
MIC-3
гени промотор
регионларини ўзида тутган бир неча трансген ғўза ўсимликлари олинди
(5-расм) ва улар навбатдаги молекуляр ва функционал босқичларда
тавсифлаш учун ўстирилмоқда. Илдиз учун специфик бўлган бу ноѐб
промотор фақатгина ўсимлик илдизида ҳар қандай ген экспрессиясини
амалга ошириш учун ўсимликлар биотехнологияси соҳасида фойдали
бўлиши мумкин. Шунингдек,
MIC-3
генлари учун синтетик РНК
дуплексларидан иборат бинар векторлар асослари яратилган ва
оптималлаштирилган бўлиб, улар ушбу генлар фаоллигини ўрганиш учун
тайѐрлаб қўйилган.
5-расм.
MIC-3
специфик промотор конструкциялари қўлланилган ғўза
трансформацияси ва соматик эмбриогенези:
A – гипокотил кесмалари; B – каллусогенез; C – соматик регенерация қилинган эмбрион
ўсимликлар; D – илдиз ва ниҳоллар ривожланиши; E – тупроқли тувакларга кўчириш.
ХУЛОСА
«Ғўзада (
Gossypium
spp
.
) патогенларга чидамлиликни белгиловчи
MIC-3
кластер генлар оиласини клонлаш, тавсифлаш ва молекуляр эволюциясини
ўрганиш ҳамда бу генларнинг ғўза биотехнологиясидаги аҳамияти»
мавзусидаги докторлик диссертацияси бўйича олиб борилган тадқиқотлар
натижасида қуйидаги хулосалар тақдим этилди:
1. Биринчи марта комплекс, йирик, фақат ғўза учун хос бўлган ва
илдизда экспрессияланувчи
Gossypium
тури аллотетраплоид ва диплоид ғўза
геномларида
MIC-3
ген оиласининг жойлашган ўрни ва структураси
аниқланди, клонланди ҳамда секвенс қилинди.
2. 15 та ғўза генотипларидан жами 169 та
MIC-3
гени аъзоларининг ҳар
бир генотип/турлари 2-10 та субоилалардан, 4-16 тагача ген аъзоларидан
иборат эканлиги билан изоҳланади.
23
3. Барча
MIC-3
гени аъзолари нуклеотидлар полиформизми (SNPs) ва
тахминий гаплотиплари филогенетик гуруҳ жиҳатдан жами 17 та геном
специфик субоилаларга мансублиги билан тасдиқланади.
4. Аллотетраплоид геномлардан ажратиб олинган
MIC-3
гени
аъзоларининг кейинги таҳлилари натижасида аниқланган A
t
-ѐки D
t
-геномлар
учун хос бўлган 42 гаплотип кетма-кетликлардан
MIC-3
гени спецефик SNP
полиформизмларни аниқлашда фойдаланиш тавсия этилади.
5. Биринчи марта
MIC-3
асосида геном специфик SNP маркерлари
яратилган ҳамда гаплотипик ассоциациялари ва узун-ПЗР тажрибалари
ѐрдамида
G. hirsutum
тури 4- ва 19-хромосомаларининг гомелог
сегментларида
MIC-3
гени аъзоларининг кластерли жойлашувлари
исботланди.
6. Биринчи марта 15 та тетраплоид ва диплоид ғўза генотипларида
нуклеотид алмашинуви тезлиги ва
MIC-3
мультиген оиласининг молекуляр
эволюцияси асосланган.
MIC-3
гени оиласининг ДНК кетма-кетликларини
кодлаш учун синоним (d
S
) ва носиноним (d
N
) нуклеотидлар алмашинувининг
ўртача миқдорини баҳолаш орқали ғўза геномида ушбу ген оиласининг
селектив чекловлари ва молекуляр эволюцияси аниқланди.
7.
Молекуляр
эволюциянинг
бошида
турғунлаштирувчи
«ҳамкорликдаги» эволюция амалга ошган бўлсада,
MIC-3
генлари «туғилиш
ва ўлим» эволюцион модели остида 1-экзонда тозаловчи ва 2-экзонда
дивергенцияловчи селекция таъсирида эволюцияланиб бориши билан
асосланади.
8. Натижалар «ген амплификацияланиши»
MIC-3
генлари барча
дупликацияланган
нусхаларининг
сақланиб қолишини таъминловчи
механизм сифатида эканлиги ва ғўзани ҳимояланиш жараѐнида генларнинг
янги функцияларини «шарпали ўлжа» модели остида яратилиши билан
изоҳланади.
9.
MIC-3
генларининг дупликацияси аллотетраплоид геномларда ҳар ~1
миллион йилда, A/F геномларда ҳар ~2 миллион йилда ва D геномларда ҳар
~8 миллион йилда битта дупликация содир бўлиши аниқланган ген
дупликацияси намунаси ғўза геноми эволюциясида патоген воситасидаги
селекция жараѐнларининг ролини тушуниш учун тавсия этилади.
10. Ғўза навларининг чидамли ва чидамсиз генотипларида
Fusarium
ва
Verticillium
билан зарарланиши жараѐнида
MIC-3
генларининг юқори
даражадаги экспрессияланганлиги,
MIC-3
генларининг муҳим аҳамиятга
эгалиги билан асосланади.
11. Илк маротаба ғўза илдизи учун хос сигнал кетма-кетлигига эга
MIC 3
промоторини ўз ичига олган 2,5 кб узунликдаги генлараро спейсер региони
клонланган, нуклеотид кетма-кетлиги секвенс қилинган ва промотор
мотивлари тавсифланган.
12. Ғўза илдиз учун хос, минимал узунликдаги
MIC-3
гени промоторининг
нуклеотид кетма-кетликлари ҳамда синтетик РНК дуплексларига эга бир
нечта генетик бинар векторлар тузилди, трансформация қилинди ва улар
ўсимликлар биотехнологияси учун тавсия этилди.
24
РАЗОВЫЙ НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЕНОЙ
СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК НА ОСНОВЕ НАУЧНОГО СОВЕТА
14.07.2016.В.15.01 ПРИ ИНСТИТУТЕ ГЕНОФОНДА
РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО МИРА, НАЦИОНАЛЬНОМ
УНИВЕРСИТЕТЕ УЗБЕКИСТАНА, ИНСТИТУТЕ ГЕНЕТИКИ И
ЭКСПЕРИМЕТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ЦЕНТР
ГЕНОМИКИ И БИОИНФОРМАТИКИ
БУРИЕВ ЗАБАРДАСТ ТОЖИБАЕВИЧ
КЛОНИРОВАНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА ГЕНОВ
MIC-3,
ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬК ПАТОГЕНАМ
ХЛОПЧАТНИКА (
GOSSYPIUM
SPP
.
) И ИЗУЧЕНИЕ ИХ
МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭВОЛЮЦИИ, А ТАКЖЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭТИХ
ГЕНОВ В БИОТЕХНОЛОГИИ
03.00.14 – Геномика, протеомика и биоинформатика
(биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ ДОКТОРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ
ТАШКЕНТ – 2016
25
Тема докторской диссертации зарегистрирована в Высшей аттестационной комиссии
при Кабинете Министров Республики Узбекистан за № 14.07.2016/В2016.3.B158.
Докторская диссертация выполнена в Центре геномики и биоинформатики АН РУз.
Автореферат диссертации на трех языках (узбекский, русский, английский) размещѐн на
веб-странице Научного совета (www.flora-fauna.uz) и Информационно-образовательном портале
«ZiyoNET» (www.ziyonet.uz).
Научный консультант Абдурахмонов ИброхимЮлчиевич
доктор биологических
наук, профессор
Официальные оппоненты: Мухамедов Рустам Султанович
доктор биологических
наук, профессор
Турдикулова Шахлохон Уткуровна
доктор биологических наук
Ризаева София Мамедовна
доктор биологических наук, профессор
Ведущая организация: Институт микробиологии
Защита диссертации состоится «____» _____________ 2016 года в ____ часов на заседании
разового Научного совета на основе Научного совета 14.07.2016.В.15.01 при Институте генофонда
растительного и животного мира, Национальном университете Узбекистана и Институте генетики
и экспериментальной биологии растений (Адрес: 100053, г.Ташкент, ул. Богишамол, дом 232.
Актовый зал Института генофонда растительного и животного мира. Тел.: (+99871) 289-04-65,
факс (+99871) 262-79-38, e-mail: igppa@academy.uz).
С докторской диссертацией можно ознакомиться в Информационно-ресурсном центре
Института генофонда растительного и животного мира (зарегистрировано за № __). Адрес:
100053, г.Ташкент, ул. Богишамол, дом 232. ИГРЖМ. Тел.: (+99871) 289-04-65.
Автореферат диссертации разослан « ____ » _______________2016 года.
(реестр протокола рассылки №___ от «____ » _______________2016 года)
К.Ш. Тожибаев
председатель Научного совета по присуждению
учѐной степени доктора наук, д.б.н.
Б.А. Адилов
ученый секретарь Научного совета по
присуждению учѐной степени доктора наук,
к.б.н., старший научный сотрудник
Ш.Юнусхонов
председатель научного семинара при Научном
совете по присуждению учѐной степени доктора
наук, д.б.н., профессор
26
ВВЕДЕНИЕ (Аннотация докторской диссертации)
Актуальность и востребованность темы диссертации.
В связи с
углублением глобализации на сегодняшний день усилена обеспокоенность в
обеспечении биологической безопасности в мировом сельском хозяйстве и
защите его от биотических (в виде фитопатогенов и вредителей) угроз. «Вред
патогенных организмов в мировом сельском хозяйстве, оценен в 1,4
триллиона долларов. Это равно 5% глобальной валовой внутренней
продукции»
1
.
За годы независимости, в нашей стране ведутся широкомасштабные
работы по повышению урожайности сельскохозяйственных культур и на
сегодняшний день сельскохозяйственное производство составляет часть
ежегодного экономического дохода страны. При этом осуществляются
реформы в отрасли хлопководства и на основе проводимых программных
мер получены определѐнные результаты, то есть, сокращены площади
посевов хлопчатника и увеличена урожайность в среднем на 3-4 центнера.
В процессе производства хлопка во всѐм мире разные патогены, такие
как, вилт (
Fusarium
и
Verticillium
) и образующая галлы в корнях хлопчатника
нематода (
Meloidogyne incognita;
RKN) наносят большой вред урожаю. На
нематоды приходится примерно 14% от всех мировых потерь, что
выражается в сумме около $ 100 млрд. долларов в год. «Значительные потери
урожая хлопка в США за последние 10 лет из-за нематоды оцениваются
примерно в 205 млн. долларов в год»
2
. С этой точки зрения, проблема борьбы
с патогенами действительно является одной из важнейших задач мировых
исследований
на
хлопчатнике,
поэтому
необходимо
исследовать
распространение болезней, а также развивать современные методы
биотехнологии. Проведение исследований по изучению генетических основ
борьбы с нематодой обосновываются следующим образом: необходимо
выявление генов; придающих устойчивость к патогенам у хлопчатника;
обоснование их структуры и состава в геноме хлопчатника; определение
места расположения на хромосомах; исследование современных средств
биотехнологии и геномики для получения устойчивых к патогенам линий.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит
выполнению задач, предусмотренных Законом Республики Узбекистан
№116-II «О защите сельскохозяйственных растений от вредителей, болезней
и сорняков» от 31 августа 2000 г., Постановлением Кабинета Министров
Республики Узбекистан №148 «О мерах по совершенствованию структуры и
повышению эффективности службы защиты растений» от 29 марта 2004 г., а
также другими нормативно-правовыми документами, принятыми в данной
сфере.
Соответствие исследования приоритетным направлениям развития
науки и технологий республики
. Данное исследование выполнено в
соответствии с приоритетным направлением развития науки и технологий
1
http://www.fao.org/docrep/018/i3300e/i3300e.pdf.
2
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNematode.aspx
27
Узбекистана V. «Сельское хозяйство, биотехнология, экология и защита
окружающей среды».
Обзор зарубежных научных исследований по теме диссертации
.
Научные исследования, направленные на молекулярно-генетическое
изучение устойчивости хлопчатника (
Gossypium
spp
.
) к патогенам
осуществляются в ведущих научных центрах и высших образовательных
учреждениях мира, в том числе, Texas A&M University (США), Mississippi
State University (США), University of California (США), University of Georgia
(США), CSIRO Plant Industry (Австралия), United States Department of
Agriculture (США), Northeast Institute of Geography and Agroecology (Китай), а
также в Центре Геномики и биоинформатики (Узбекистан).
В результате исследований, проведенных в мире по молекулярно
генетическому изучению устойчивости хлопчатника (
Gossypium
spp
.
) к
патогенам получен ряд научных результатов: выявлена взаимосвязь между
нематодами и вилтом, опасности нематоды и вилта в комплексе, а также
обнаружены несколько ДНК-маркеров, связанных с этой болезнью (California
University, США); картировали, используя микросателлитные маркеры, QTL
локусы устойчивости к RKN на хромосомах 11 и 14 упланд-хлопчатника
(United States Department of Agriculture, США); выявлены Mi-C11 и Mi-C14
локусы при использовании большого числа ДНК маркеров (SSR и AFLP
маркеры) и обследований 1221 F
2
особей генетической популяции (Georgia
University, США).
В мире по молекулярно-генетическому изучению устойчивости
хлопчатника (
Gossypium
spp.) к патогенам по ряду, приоритетных
направлений, проводятся исследования, в том числе: определение новых
генов устойчивости к патогенам; QTL картирование с помощью ДНК
маркеров; определение места расположения устойчивых генов к патогенам на
хромосомах; получение новых биотехнологических сортов, устойчивых к
патогенам
Степень
изученности
проблемы
.
Большинство
известных
мультигенных кластерных генов связанных с устойчивостью, выявлены
зарубежными учеными B.J.DeYoung et al.
3
; характеристика и генетическое
картирование генов, кодирующих NBS-LRR белки устойчивости, у
аллотетраплоидного хлопчатника определяли L.He et al.
4
; высокая экспрессия
уникального корень-специфичного
MIC-3 (Meloidogyne Induced Cotton-3)
белка хлопчатника из тканей растений, устойчивых к нематоде, при
инфицировании нематодами была выявлены X.D.Zhang at al.
5
, F.E.Callahan at
3
DeYoung BJ, Innes RW. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense. Nat Immunol. 2006
Dec;7(12):1243-9.
4
He L., Du C., Covaleda L., Xu Z., Robinson F.A., Yu J.Z., Kohel R.J., Zhang H.B. Cloning, characterization, and
evolution of the NBS-LLR-encoding resistance gene analogue family in polyploid cotton (
G. hirsutum
L.) // Mol
Plant Microbe Interact. 2004. 17:1234–1241.
5
Zhang X.D., Callahan F.E., Jenkins J.N., Ma D-P., Karaca M., Saha S., Creech R.G. A novel root-specific gene,
MIC-3
with increased expression in nematode-resistant cotton (
G. hirsutum
L.) after root-knot nematode infection //
Biochim.Biophys.Acta. 2002. 1576:214-218
28
al.
6
; тогда как M.Wubben at al
7
показали, что мотивы устойчивости или
домены «NBS-LRR like» не связаны, кроме того они определили
предварительные свойства семейства
MIC-3
генов во время защитных
реакций растений и доказали, что эти гены независимы от других известных
защитных путей.
В Узбекистане генетическое изучение упланд-хлопчатника «Голиб»,
устойчивого к нематодам, проведено Х.Холматовым. Ш.Эгамбердиевым
комплексно идентифицированы молекулярно-генетическими методами
патогены рода
Fusarium,
а также изучены патогенные свойства видов и рас
патогенов, встречающихся значительно чаще по отношению к местным
сортам хлопчатника. Однако, кластерные супергены устойчивости к
заболеваниям у хлопчатника еще не изучены полностью, как на
национальном, так и на международном уровне. В данный момент, с научно
практической точке зрения очень важно изучение молекулярной эволюции и
характеристики семейства кластерных генов
MIC-3
, определяющих
устойчивость к патогенам на хлопчатнике (
Gossypium
spp.) а также,
применение этих генов в биотехнологии.
Связь темы диссертации с научно-исследовательскими работами
научно-исследовательского учреждения, где выполнена работа.
Диссертационное исследование выполнено в рамках плана научно
исследовательских работ фундаментальных, прикладных и международных
проектов Центра геномики и биоинформатики: Ф4-T149 «Исследование
структуры и функции генома хлопчатника для разработки маркер
ассоциированной селекции» (2007-2011 гг.); UZB2-3101-TA-09 «Оценка
потенциальной гермоплазмы устойчивости против галловой нематоды и
фузариозного вилта и разработка кандидатных генетических маркеров,
основанных на SNP» (2009-2013 гг.); «Получение высококачественных
трансгенных линий хлопчатника с помощью бинарных генетических
векторов, основанных на синтетических RNAi дуплексах, созданных для
генов хлопчатника» (2009-2011 гг.).
Целью исследования
является определение состава, структуры,
расположения на хромосомах, а также механизмов дупликации и
молекулярной эволюции
MIC-3
генов у аллотетраплоидных и близких к их
предкам диплоидных геномов хлопчатника.
Задачи исследования:
клонировать и секвенировать все члены семейства
MIC-3
генов
аллотетраплоидных и считающихся близкими к их предкам диплоидных
геномов у видов
Gossypium
;
выполнить подробный филогенетический анализ и классификацию
MIC-3
генов на подсемейства у видов
Gossypium
;
6
Callahan F.E. Zhang X-D., Ma D-P., Jenkins J.N., Hayes R.W., Tucker M.L. Comparison of
MIC-3
protein
accumulation in response to root-knot nematode infection in cotton lines displaying a range of resistance levels // J
Cotton Sci. – USA, 2004. 8:186-190.
7
Wubben M.J., Callahan F.E., Hayes R.W., Jenkins J.N. Molecular characterization and temporal expression analyses
indicate that the
MIC
(
Meloidogyne-induced cotton
) gene family represents a novel group of root-specific
defense-related genes in upland cotton (
G hirsutum
L.) // Planta. 2008. 228:111-123.
29
выявить предположительные гаплотипы
MIC-3
последовательностей в
геноме хлопчатника и разработать SNP маркеры для подтверждения
кластерной локализации членов
MIC-3
генов на специфических хромосомах,
полезных для будущих программ маркер-ассоциированной селекции;
охарактеризовать предполагаемые белковые последовательности и
скорости нуклеотидных замещений для изучения моделей и скорости
молекулярной эволюции, дупликации генов и механизмов поддержания
мультигенного семейства
MIC-3
до и после аллополиплоидизации в геноме
хлопчатника;
исследовать эволюцию генома хлопчатника на основе информации
MIC 3
генов и повторно оценить время дивергенции геномов в роде
Gossypium
;
исследовать адаптивные селекционные паттерны на основе синонимичных и
несинонимичных коэффициентов замещения, способствующих устойчивости
к нематодам и болезням;
сравнительно исследовать экспрессию
MIC-3
генов при инфицировании
Fusarium
и
Verticillium
у устойчивых и неустойчивых генотипов хлопчатника;
выявить
межгенные
спейсерные
последовательности
между
несколькими
MIC-3
генами и на их основе создать бинарные векторы,
содержащие в себе минимальный промоторный регион и трансформировать
их в модельное растение
Arabidopsis
для определения в дальнейшем
полезных для биотехнологии хлопчатника и растений промоторных
последовательностей;
сконструировать и оптимизировать основы бинарных векторов,
содержащих РНК дуплексы, для изучения функции растительных генов,
включая
MIC-3
гены
.
Объект
исследования.
В
качестве
растительного
материала
использованы удвоенный гаплоид вида
G. barbadense
Pima 3-79 ([AD]
2
-
геном),
G. tomentosum
([AD]
3
-геном),
G. mustelinum
([AD]
4
-геном) и 9
генотипов
G. hirsutum
([AD]
1
-геном), включая линию и сорта Clevewilt,
M240, M315, Голиб, ST213, M8, Texas Marker-1 (TM-1), чувствительные
изолинии (Sisoline) и красные мутантные линии (REDM). Кроме этого, тремя
диплоидами, включенными в исследование, являлись
G. Herbaceum
(A
1
-геном) и
G. raimondii
(D
5
-геном), геномы, которые наиболее
близкородственны к A
t
-(A-субгеном) и D
t
-(D-субгеном) геномам, ныне
существующих AD тетраплоидных видов, и F-геном африканского дикого
хлопчатника
G. longicalyx.
Использовано делеционное тестирование для
определения хромосомной локализации
MIC-3
генов путем скрининга
полиморфизмов у моносомных и монотелодисомных интерспецифичных F
1
гибридов
G. hirsutum
x
G. barbadense
и аналогичных первичных моносомных
F
1
гибридов
G. hirsutum
x
G. mustelinum.
Предметом исследования
являются уникальные гены
MIC-3
, которые
управляют устойчивостью к заболеваниям, выявленные из 15 тетраплоидных
и диплоидных генотипов хлопчатника.
Методы исследования.
В работе были использованы основные методы
30
молекулярной биологии (выделение ДНК, секвенирование и клонирование
генов), анализ генетической структуры, филогенетическое кластерирование,
методы генной рекомбинации и конверсии, времени молекулярно
эволюционной дивергенции, разработки маркеров и бинарных векторных
конструкций, генетической трансформации, а также современные методы
биоинформатики и статистического анализа.
Научная новизна исследования
заключается в том, что:
впервые клонировано, секвенировано и охарактеризовано
169
индивидуальных членов, принадлежащих к супергенному семейству
MIC-3
из 15 аллотетраплоидных и диплоидных генотипов;
выявлено на основе анализа 169
MIC-3
генов, что в 15 генотипах
хлопчатника имеются от 4 до 16 членов гена, которые делятся на 2-10
подсемейства. У всех видов
Gossypium
эти последовательности 169
MIC-3
генов были филогенетически разделены в общем количестве на 17 геном
специфичных подсемейств;
доказано
на
основе
анализа
MIC-3
генов, выявленных у
аллотетраплоидных видов, наличие 42 гаплотипных последовательностей,
характерных для A
t
- и D
t
-геномов. Были созданы SNP маркеры, идентичные
MIC-3
генам и на основе гаплотипных и подсемейственных групп, были
определены 9 предполагаемых
MIC-3
локусов в А
t
-геноме и 3
предполагаемых локуса в D
t
-геномах аллотетраплоидного хлопчатника;
впервые созданы SNP маркеры, полученные из геном-специфичных
MIC-3
генов, и выявлено, что
MIC-3
гены расположены в кластерном виде на
4- и 19-гомеологичных хромосомах хлопчатника;
впервые определены скорости нуклеотидных замен и процессы
молекулярной эволюции
MIC-3
генов у 15 тетраплоидных и диплоидных
генотипов хлопчатника;
выявлено на основе оценки среднего числа синонимичных (d
S
) и
несинонимичных
(d
N
)
нуклеотидных
замен
для
кодирующих
последовательностей ДНК семейства
MIC-3
генов, что несмотря на ранюю
«совместную» эволюцию, семейство
MIC-3
генов видов хлопчатника
развивается путем эволюции «рождения и смерти» с изолирующим отбором
в экзоне-1 и дивергентной селекцией в экзоне-2;
впервые определена «амплификация гена» как возможный механизм
сохранения всех дублирующих копий
MIC-3
генов и появление новых
функций генов в процессе защиты хлопчатника в рамках модели
«исчезающей приманки»;
доказано, что дупликации
MIC-3
генов в различных геномах происходили с
различными скоростями. Выявлено, что одна дупликация происходит один
раз за ~1 миллион лет у аллотетраплоидов, один раз в ~2 миллиона лет у A/F
геномов, и один раз в ~8 миллионов лет у D-геномов;
по анализу экспрессии
MIC-3
генов выявлена активность генов у
генотипов, устойчивых к вилту
Fusarium
и
Verticillium
;
впервые клонирована, секвенирована и охарактеризована межгенная
спейсерная последовательность региона длиной в 2,5 kb, содержащая корень-
31
специфичный промотор гена
MIC-3
.
Практические результаты исследования
заключаются в следующем:
охарактеризована последовательность семейства генов
MIC-3
в ДНК, которая
рекомендуется как основа для использования в повышении устойчивости к
вилту и нематоде в программах современной селекции и биотехнологии
хлопчатника;
разработаны SNP маркеры для
MIC-3
генов, которые рекомендуются для
использования в маркер-ассоциированной селекции (МАС) хлопчатника для
создания новых сортов;
составлено несколько бинарных генетических векторов, состоящих из
маркерных генов
GUS
с последовательностями промотора
MIC-3,
которые
трансформированы в модельное растение
Arabidopsis
. Рекомендуется,
корень-специфичный минимальный промотор гена
MIC-3,
являющийся очень
полезным в биотехнологии растений;
созданы синтетические RNAi векторные конструкции, используемые
при изучении активности генов в биотехнологии растений, получены новые
линии в биотехнологии хлопчатника.
Достоверность результатов исследования
была подтверждена с
помощью современных методов и подходов. Данные были обработаны,
проанализированы
и утверждены с использованием классических
статистических методов, таких как вариационный анализ данных (ANOVA),
анализ молекулярной вариации (AMOVA),анализ Wilcoxonа и современные
алгоритмы анализа последовательностей (Sequencher, ClustalX, Mega 4.1,
BLASTX), методы филогенетического анализа (UPGMA, Mega 4.1, NJ), тесты
генной конверсии и рекомбинации (GeneConv, DNASP, RDP3, SiScan) и
анализ степени замещения (KaKs с поправками Juke-Cantor, Z-тесты на
основе кодонов). Изменение синонимичных нуклеотидов в геноме
хлопчатника в течение многих лет рассчитывали по формуле r= Ks/2T.
Научная и практическая значимость результатов исследования
.
Научная
значимость
результатов
исследования
интерпретируется
обеспечением впервые полученных новейших знаний и пониманий о
молекулярной эволюции, селективных силах, а также впервые обнаруженной
«амплификации гена», как возможного механизма сохранения всех
дупликаций копий
MIC-3
генов у диплоидных и тетраплоидных видов
хлопчатника и появлением новых функций генов при защите хлопчатника в
рамках модели «исчезающей приманки» («bait and switch»).
Практическая значимость работы заключается в том, что SNP маркеры,
полученные из
MIC
-
3
генов, сформированные на основе позитивной
селекции и обеспечивающие повышенную устойчивость хлопчатника к
заболеваниям, могут использоваться для современных МАС программ при
создании сортов, устойчивых к нематодам и вилту, а также промотор
MIC-3
гена, может быть эффективно использован в биотехнологии растений для
перенаправления функций любых генов к корням хлопчатника и других
растений, в обеспечении безопасности многих трансгенных событий и
созданием синтетических RNAi векторных конструкций, используемых в
32
изучении активности генов.
Внедрение результатов исследования
. Благодаря изучению
молекулярной эволюции и характеристики семейства кластерных генов
MIC-3
, а также на основе результатов, полученных в рамках использования
этих генов в биотехнологии хлопчатника:
получены патенты (12.01.2011, № IAP 04300; 02.06.2011, № IAP 04383;
23.05.2011, № IAP 04360; 23.05.2011, № IAP 04361) на изобретение
Интеллектуального агентства Республики Узбекистан на метод малой
интерферирующей РНК (siRNA) для подавления генной экспрессии в
растительных клетках. Результаты научного исследования позволили создать
новые линии путем трансформации векторных конструкций генов
биотехнологии растений, например, за счет изучения активности
MIC-3
генов;
кластерные гены
MIC-3
использованы в рамках проекта № 6064-21000-
014-00-D «Генетическое улучшение хлопчатника с помощью маркер
ассоциированной и традиционной селекции, и интрогрессия генов из
экзотических видов
Gossypium»
(2013 – 2018 годы), профинансированного
Департаментом сельского хозяйства США (справка United Statates Department
of Agriculture от 26 сентября 2016 года). При использовании кластерных
генов
MIC-3
создана возможность получения устойчивых к нематодам линий,
а также повышения устойчивости хлопчатника к патогенам.
Апробация результатов работы
. Результаты исследования изложены в
виде лекций и прошли апробацию на 13 международных и республиканских
научно-практических конференциях, в том числе «Conference of American
Society of Agronomy» (New York, 2006), «Ўсимликлар молекуляр
биологиясининг долзарб муаммолари» (Тошкент, 2008), «Ғўзанинг дунѐ
генетик хилма-хиллиги асосий ва амалий лойиҳалар асосида» (Тошкент,
2010), «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), «Актуальные проблемы
развития биоорганической химии» (Ташкент, 2010), «International Cotton
Genome Initiative сonference» (Canberra, 2010), «5
th
World cotton Research
Conference» (Mumbai, 2011), «International Cotton Genome Initiative (ICGI)
conference» (Brasilia, 2006; Raleigh, 2012), «International Cotton conference»
(Bremen, 2014), «Генетика, геномика ва биотехнологиянинг замонавий
муаммолари» (Тошкент, 2016).
Опубликованность результатов исследования
. По теме диссертации
опубликовано всего 28 научных работ. Из них 10 научных статей, в том числе
5 в республиканских и 5 в зарубежных журналах, рекомендованных Высшей
аттестационной комиссией Республики Узбекистан для публикации
основных научных результатов докторских диссертаций, а также получены 4
республиканских патента, связанных с методами использованными в данной
работе.
Структура и объем диссертации.
Структура диссертации состоит из
введения, пяти глав, заключения, списка использованной литературы и
приложений. Объем диссертации составляет 171 страниц.
33
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Во Введении
обосновывается актуальность и востребованность
проведенного исследования, цель и задачи исследования, характеризуются
объект и предмет, показано соответствие исследования приоритетным
направлениям развития науки и технологий республики, излагаются научная
новизна и практические результаты исследования, раскрываются научная и
практическая значимость полученных результатов, внедрение в практику
результатов исследования, сведения по опубликованным работам и структуре
диссертации.
В первой главе диссертации под названием
«Гены резистентности и
успехи геномики устойчивости»
приведены молекулярно-генетические
исследования, проведѐнные по хлопчатнику.
Перечислены, использование генов устойчивости в биотехнологии
растений, молекулярная эволюция и их характеристика, а также основные
проблемы данного направления, обсуждены возможные пути их решения.
Вторая глава диссертации под названием «
Материалы, условия и
методы исследования кластерных генов хлопчатника
» посвящается
методам, использованным в исследование.
Здесь приведено детальное описание растительного материала и
использованных реагентов, методов выделения ДНК, клонирования,
секвенирования ДНК и анализа последовательностей с использованием
методов филогении, гаплотипирования, генной конверсии, рекомбинации и
молекулярной эволюции с применением современных статистических
подходов.
В третьей главе диссертации под названием «
Характеристика и
хромосомная локализация
MIC-3
генов у видов
Gossypium
» изучены
состав, структура и расположение семейства генов
MIC-3
, а также,
клонированы, секвенированы и охарактеризованы аллотетраплоидные и
диплоидные геномы хлопчатника.
Исследования включают в себя следующие результаты:
Примерно 150 индивидуальных клональных инсерций, полученных при
помощи ПЦР, для продуктов
MIC-3
генов секвенировали из каждого для 15
генотипов хлопчатника. Ампликоны
MIC-3
генов видов рода
Gossypium
колебались от 653-706 п.о., включая 653-706 п.о. длины ампликона у всех
аллотетраплоидных генотипов, 703-713 п.о. ампликонов у
G. herbaceum
,
653-691 п.о. ампликонов у
G. raimondii
, и 706 п.н. ампликонов у
G. longicalyx
(таблица 1).
Множественное выравнивание последовательности формирует
MIC-3
полноразмерную консенсусную последовательность в 721 п.о для всех
изученных видов
Gossypium
. Интронные и экзонные части
MIC-3
генов вида
Gossypium
были аннотированны, согласно
MIC-3
нуклеотидной и белковой
последовательности (Zhang et. al., 2002).
34
Таблица 1
Характеристика семейства
MIC-3
генов видов
Gossypium
Генотип
Число
членов
Вариация
длины
ампликона
Инсерционно-делеционн
ые изменения
Общие
SNP
экзон 1 интрон 3' UTR
Gh_TM1
10
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Sisoline
11
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_ST213
11
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_M8
12
697 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
-
-
17 (A
t
),
20 (D
t
)
Gh_REDM
13
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Golib
16
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
15
-
21 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_Clevewilt
13
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M240
9
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M315
15
653 (D
t
)
697 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
-
-
18 (A
t
),
27 (D
t
)
Gb_3-79
11
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9
-
-
-
-
15,29
15
11 (A
t
),
29 (D
t
)
G. tomentosum
9
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15,29
-
10 (A
t
),
24 (D
t
)
G. mustelinum
15
653 (D
t
)
668 (A
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9*
9
-
-
-
-
-
15,29
29
15
-
12 (A
t
),
28 (D
t
)
G. herbaceum
9
703
707
709
713
-
-
-
-
12
8
6
8
6
6
6
-
19 (A)
G. raimondii
4
651
653
691
9
9
-
-
-
-
31
29
-
33 (D)
G. longicalyx
11
706
-
-
-
14 (F)
*
Обратите внимание:
9 п.о. вставок в первом экзоне A
t
-генома специфичного
ампликона
MIC-3
гена
G. mustelinum
имеет триплет, расположенный выше по сравнению
другими D
t
- геномными специфическими вставками, наблюдаемыми у других генотипов.
Gh –
G. hirsutum
; Gb –
G. barbadense
.
35
Множественное выравнивание геномных последовательностей из всех
видов
Gossypium
в
нашем
исследовании
показало,
что
наши
последовательности соответствуют 11 п.о. из некодирующей 5 'UTR области,
двум кодирующим областям в 221-230 п.о. (экзон 1) и 193 п.о. (экзон 2),
единой некодирующей интронной области в 65-77 п.о. и некодирующей 3'
UTR области в 151-195 п.о. гена
MIC-3
. Изменения были связаны с
большими инсерционно-делеционными (indel) изменениями, наблюдаемыми
у некоторых членов семейства
MIC-3
генов в каждом изученном генотипе
хлопчатника. Например, все изученные генотипы хлопчатника, за
исключением
G. herbaceum
(A-геном), имели специфическую D-геномную
вставку в 9 п.о. в первом экзоне. Интересно отметить, что наблюдалось
появление смещения положения триплета на 9 п.о. вверх в пределах
A-генома, сгруппированных (см филогенетическая группировка согласно
мутациям SNP) по
MIC-3
ампликонам
G. mustelinum
(таблица 1).
Кроме того, все аллотетраплоидные родословные, за исключением сорта
M8
G. hirsutum
, имели две другие крупные вставки из 15 пар оснований и 29
пар оснований, найденные в 3'UTR области, из которых 29 пар оснований
вставки (как структура, так и положение установлены) связаны с
предположительным D-геномным предком аллотетраплоидов –
G. raimondii
.
Вставка из 15 пар оснований была уникальна и обнаруживалась только у
изученных аллотетраплоидных генотипов и не была связана ни с А-, ни с
D-геномом предполагаемых диплоидных предков. Изучая паттерны вставки в
3'UTR из
MIC-3
ампликонов из AD хлопчатника (таблица 1), более сложные
ампликоны с комбинацией вставки 15 и 29 п.о. были обнаружены у
G.
mustelinum
(3 разных типа), линии Pima 3-79
G. barbadense
(два типа) и сорта
Голиб
G. hirsutum
(два вида). При этом паттерны вставки у линии Pima
3-79
G. barbadense
и сорта Голиб
G. hirsutum MIC-3
были сходными, где
только возникновение ампликонов вставки с 15 п.о. было уникальным для
этих генотипов, предполагая интрогрессию между
G. barbadense
и сортом
Голиб. С другой стороны, либо 15, либо 29 пар оснований вставки в 3'UTR
любого из
MIC-3
членов не были найдены среди всех клонов сорта M8
G.
hirsutum
. Только 12 членов генов
MIC-3
были обнаружены у М8. Wubben
и др. (2008) сообщали о 15 различных членах из того же генотипа M8. Это
может быть связано с отсутствием некоторых из
MIC-3
членов при ПЦР
клонировании в этой работе.
169 членов
MIC-3
генов были сгруппированы в 17 различных
подсемейств в филограмме (рисунок 1). 110 членов
MIC-3
генов из генотипов
G. hirsutum
были сгруппированы в 12 подсемейств, из которых подсемейства
от 1 до 9, были специфическими для A
t
-генома и от 10 до 12 – для D
t
-генома
(рисунок 1). Подсемейства 13 и 14 были специфическими для
G. herbaceum
,
подсемейство 15 – для
G. longicalyx
, и подсемейства 16 и 17 – для семейства
MIC-3
генов
G. raimondii
. Все аллотетраплоидные члены
MIC-3
гена, за
исключением одного члена из
G. mustelinum
(
MIC-3
_14), были
сгруппированы в 12 подсемейств
G. hirsutum
(рисунок 1). Однако,
MIC-3
_14
36
Рисунок 1. Кривая филогенетического дерева методом ближайших соседей,
полученная из 86 различных MIC 3-генов видов
Gossypium
:
Показаны бутстреп
значения (> 50%).
37
был сгруппирован в рамках 13-го подсемейства, найденного у A-генома. Как
G. herbaceum
, так и
G. raimondii
, предполагаемые A- и D-геномные предки
AD хлопчатника, имели два различных подсемейства. Наблюдалось
присутствие
некоторых
видоспецифичных
подсемейств.
Например,
подсемейство 1 было обнаружено только у
G. hirsutum
, включая
чувствительные изолинии (S-изолинии), ST213 и Clevewilt, подсемейство 8
включает последовательности M315 и подсемейство 11 содержит
последовательности М8 и M315 упланд сортов.
Для идентификации гаплотипов
MIC-3
генов у тетраплоидного
хлопчатника, из-за широкого представительства различных групп линий от
этого вида в данном исследовании были использованы филограммы
MIC-3
генов, полученные из
G. hirsutum
Neigbour Joining. Гаплотипы
G. hirsutum
(AD) были разделены на две предполагаемые большие группы:
1) A
t
-геномные гаплотипы и 2) D
t
-геномные гаплотипы, согласно
кластеризации
соответствующими
предполагаемыми
диплоидными
предками,
G. herbaceum
и
G. raimondii
. Консенсусные последовательности
G.
herbaceum
и
G. raimondii
использовались в качестве референсных
последовательностей в гаплотипных таблицах (см. диссертацию).
В
соответствии с классификацией подсемейства
MIC-
3 генов у
G. hirsutum
(смотри
выше),
результаты
показали, что А
t
-геном имел
9
предположительных локусов (гаплотипных групп) со средним значением 3,5
аллеля или гаплотипа/локуса, а D
t
-геном состоял из 3 предположительных
локусов (гаплотипных групп) со средним значением 3,3 аллеля или
гаплотипов/локуса у
G. hirsutum
. Число гаплотипов или предполагаемых
аллелей на предполагаемый локус колебалась от 2-6 в А
t
-геноме до 4-6 в D
t
геноме. Тетраплоидные
MIC-3
последовательности включали 25 SNP в А
t
геноме и 26 SNP в Dt-геноме, где все были биаллельными, за исключением
позиции 113 (A, D), 162 (D) и 568 (D). Среднее число пар оснований на SNP в
А
t
-геноме по сравнению с Dt- геномом составляло 182,6 п.о. и 108,8 п.о.,
соответственно.
Согласно раздельному филогенетическому анализу (рисунок 2) и
анализу последовательности
MIC-3
для ТМ-1 (стандартная линия для
G.
hirsutum
) и Pima 3-79 (двойная гаплоидная стандартная линия для
G.
barbadense
), для различения межвидовых геномных полиморфизмов между
этими двумя видами были разработаны несколько GSP маркеров. Эти
кандидатные генетические маркеры затем были использованы для анализа
делеций путем скрининга цитогенетических линий, в том числе моносомных,
монотелодисомных, CS-B, а также NTN гибридов (Stelly и др., 2005; Goutirez
и др., 2009).
Оба родительских типа полиморфизмов присутствовали в большинстве
гибридов F
1
. Вместе с тем, все восемь ТМ-1 GSP аллелей, представляющих 7
из
8 различных A
t
-геномов, полученных из
MIC-3
членов ТМ-1,
отсутствовали у гипоанеуплоидных F
1
растений, которые имели нехватку по
хромосоме 4
G. hirsutum
H04 моносомик) или короткого плеча хромосомы 4
(Te04L мoнотелодисомик).
38
Рисунок 2. Кривая филогенетического дерева методом ближайших
соседей, полученная из
MIC-3
генов
G. hirsutum
(ТМ-1),
G. barbadense
(Pima 3-79), а также двух предполагаемых диплоидных предков AD
хлопчатника:
Длина ветви, бутстреп значения (> 50%), хромосомные позиции, и геном происхождения
для простоты показаны и цветовым кодом.
Эуплоидные дисомные хромосом-замещенные линии CS-B04 также не
имели те же
MIC-3
аллели
G. hirsutum
для всех этих маркеров. В отличие от
этого, все восемь GSP локусов были гетерозиготными у всех других
замещенных линий и у монотелодисомных замещенных F
1
растений (Te04sh),
лишенных длинного плеча хромосомы 4. Совокупные результаты показали,
что 7 из 8 А
t
-геномов
MIC-3
члена ТМ-1 находятся на коротком плече
39
хромосомы 4, предполагая потенциальные доказательства для кластерной
локализации
MIC- 3
генов в геноме хлопчатника (рисунок 2). Хотя было
найдено несоответствие между линиями ТМ-1 и Pima 3-79 у нескольких
D
t
-геномных
MIC-3
гаплотипов, они не были полиморфными при
делеционном анализе и в экспериментах по хромосомной локализации. Это
было связано с наличием перекрывающихся сайтов в пределах линии Pima
3-79
MIC-3
членов, которые ограничивают нас при дифференцировке GSP
полиморфизмов у цитогенетических линий. Вместе с тем, подробный анализ
последовательности
MIC-3
членов, полученных из
G. mustelinum
, помог
разработать два различных GSP праймера (не полиморфных между ТМ-1 и
Pima 3-79), которые были полиморфными между ТМ-1 и
G. mustelinum
членами
MIC-3
гена, обнаруживая генотип-специфические аллели при
делеционном анализе. У третичных моносомных F
1
межвидовых гибридов
12-19 NTN и 10-19 NTN дифференцированно отсутствовала ТМ-1 аллель,
специфичная для данного SNP маркера, но не аллель
G. mustelinum
. NTN
12-19 растения сегментально дефицитные по частям ТМ-1 хромосом 12 и 19,
в то время как NTN 10-19 – сегментально дефицитные по частям ТМ-1
хромосом 10 и 19. Вместе они разграничивают один из D
t
-геномного
MIC-3
члена (
MIC
_3_10) ТМ-1 на хромосоме 19. В отличие от первичных
моносомных межвидовых гибридов H10 и H12 являются недостаточными для
хромосом 10 и 12
G. hirsutum
, но содержат ТМ-1 и GSP
MIC-3
маркеры
G.
mustelinum
.
Результат показывает, что этот
MIC-3
элемент, полученный из Dt-генома,
не находится ни в одной из этих хромосом, а также поддерживает
локализацию на хромосоме 19. Остальные гипоанеуплоидные F
1
растения не
имели нехваток по другим хромосомам, но содержали как ТМ-1, так и Pima
3-79 аллели для этого конкретного SNP маркера. Хотя первичные
моносомики для хромосомы 19 еще не существуют у
G. hirsutum
, тем не
менее, результаты ясно показывают, что этот D
t
-геномный
MIC-3
элемент
расположен на хромосоме 19
G. hirsutum
.
Анализ экспрессии генов
MIC-3
генов у ряда инфицированных и
неинфицированных вилтом генотипов хлопчатника показал, что гены
MIC-3
высоко избыточно экспрессируются в тканях, инфицированных
Fusarium
и
Verticillium
, и избыточная экспрессия была выражена выше у устойчивых
генотипов. Эти данные указывают на важность
MIC-3
генов не только в RKN
патогенезе, но и, в качестве PR-белка с потенциальной защитной функцией
при заражении вилтом и, возможно, другими болезней хлопчатника.
В четвертой главе диссертации под названием «
Молекулярная
эволюция семейства
MIC-3
генов у видов
Gossypium
» представлены
данные о скорости обмена нуклеотидов у 15 тетраплоидных и диплоидных
генотипов хлопчатника и образцы молекулярной эволюции мультигенного
семейства
MIC-3
.
Исследования включают в себя следующие результаты:
После удаления интронных и UTR областей последовательностей из
всех 169 членов
MIC-3
гена, были сформированы 131 отличительные
кодирующие последовательности ДНК для членов
MIC-3
гена из
40
15 генотипов, которые были дополнительно сгруппированы в 56 различных
белок-кодирующих предполагаемых последовательностей кДНК. Эти
кодирующие последовательности ДНК были успешно многократно
выравнены по 423 п.о. с использованием ClustalX, которая охватывает всю
кодирующую область
MIC- 3
генов, в том числе первый (231 п.н.) и второй
(192
п.н.)
экзоны.
Эти
56
отличительных
предположительных
последовательностей кДНК образуют 29 отличительных предсказанных
белковых последовательностей у всех 15 генотипов хлопчатника. В
совокупности, различия среди аминокислот были замечены у 42 из 141
аминокислотных позиций (30%) предполагаемых
MIC-3
белковых
последовательностей
видов
Gossypium
.
Имелось
большее
число
аминокислотных
изменений
у предположительных
MIC-3
белков,
полученных из D
t
-генома, по сравнению с группой белков, полученных из
A
t
-генома. Аминокислотные изменения были менее выражены у А
1
и
F-геномной группы предполагаемых
MIC-3
белков. В отличие от этого,
наибольшее число аминокислотных изменений наблюдалось у всех четырех
предположительных белков D
5
-геномных
MIC-3
генов.
Кроме того, была изучена молекулярная эволюция семейства генов
MIC-3
на основе анализа его вариации у 15 тетраплоидных и диплоидных
генотипов
Gossypium
, которые в совокупности представляют семь
филогенетически различных геномов, которые часто используются для
эволюционных исследований. Скорость синонимичных (d
S
) и не
синонимичных (d
N
) нуклеотидных замен позволяют предположить, что
второй из двух экзонов
MIC-3
генов находится под сильным положительным
давлением отбора, в то время как первый экзон был под сильным
изолирующим отбором для сохранения функции (таблица 2).
На основе коэффициентов нуклеотидных замен, мы пришли к выводу,
что
MIC-3
гены эволюционируют посредством процесса «рождения и
смерти» при сильном изолирующем отборе в экзоне-1 и дивергентном отборе
в экзоне-2 (таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют, что
механизм «амплификации гена» помогает сохранить все удвоенные копии
MIC-3
генов в геномах
Gossypium
, что наилучшим образом согласуется с
моделью «исчезающей приманки» эволюции R-гена.
Данные показывают, что дупликации
MIC-3
генов происходили с
различными скоростями, один раз за ~1 миллион лет (MY) у
аллотетраплоидов, один раз в ~2 миллион лет у A-/F-геномных
филогенетических ветвей, и один раз в ~8 миллион лет у D- геномных
филогенетических ветвей (рисунок 3). Изменения в семействе
MIC-3
генов,
как
оказалось,
отражают
эволюционный
отбор
для
повышения
функциональной устойчивости (через изолирующий отбор в экзоне-1), а
также расширение возможностей для разработки новых «переключателей»
(за счет дивергентного отбора в экзоне-2) для реагирования на различные
вредители и патогены. Такие эволюционные роли совпадают с гипотезой, что
члены этого уникального семейства генов устойчивости обеспечивают
приспособительные преимущества у
Gossypium
в борьбе с вредителями и
патогенами.
41
Таблица 2
Средние внутри-генотипные оценки нуклеотидных замен для семейства
MIC-3
генов хлопчатника
Генотипы
Геном
A
t
D
t
Итого*
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
Gh_TM-1
[AD]
1
0.80 2.19 0.37 4.19 4.33 0.97 1.85 2.57 0.72
Gh_Sisoline
[AD]
1
0.69 1.94 0.36 4.19 4.33 0.97 1.56 2.34 0.66
Gh_M315
[AD]
1
0.67 1.89 0.35 2.86 3.49 0.82 1.57 2.38 0.66
Gh_M8
[AD]
1
0.78 1.94 0.40 3.53 3.23
1.09
1.36 2.14 0.64
Gh_Clevewilt
[AD]
1
0.80 1.89 0.42 2.79 2.86 0.98 1.61 2.16 0.74
Gh_Golib
[AD]
1
0.66 2.24 0.30 4.19 4.33 0.97 1.50 2.55 0.59
Gh_M240
[AD]
1
0.76 2.09 0.36 4.19 4.33 0.97 1.67 2.46 0.68
Gh_ST213
[AD]
1
0.58 2.04 0.28 4.19 4.33 0.97 1.37 2.48 0.55
Gh_REDM
[AD]
1
0.97 1.97 0.49 4.04 3.74
1.08
1.51 2.37 0.64
Gb_Pima 3-79
[AD]
2
0.31 1.04 0.30 2.84 2.76
1.03
1.90 1.87
1.02
G. mustelinum
[AD]
4
0.39 0.79 0.49 2.30 2.11
1.09
1.73 1.34
1.29
G. tomentosum
[AD]
3
0.49 0.83 0.60 2.90 2.84
1.02
1.78 1.62
1.10
G. herbaceum
A
1
-
-
-
-
-
-
0.43 0.41
1.05
G. raimondii
D
5
-
-
-
-
-
-
3.70 2.83
1.31
G. longicalyx
F
-
-
-
-
-
-
0.35 2.37 0.15
Все
G. hirsutum
[AD]
1
2.06 0.61 0.30 2.79 2.37 0.85 1.32 2.39 0.55
Все
Gossypium
виды
-
1.90 0.58 0.31 2.57 2.20 0.86 1.80 2.58 0.70
Gh –
G.hirsutum
; Gb –
G.barbadense;
Sisoline – чувствительные изолинии; *Итого –
комбинация A
t
и D
t
; d
S
– скорость синонимичных нуклеотидных замен; d
N
– скорость
несинонимичных нуклеотидных замен; d
N
:d
S
– отношение скорости несинонимичных замен
к синонимичным, начиная с расхождения двух последовательностей, что примерно равно
d
N
:d
S
, отношение числа несинонимичных замен к синонимичным.
Примечание
: что
скорости d
N
:d
S
, значение которых больше 1, выделены жирным шрифтом; значения d
N
и d
S
умножены на 100х.
В пятой главе диссертации под названием «
Молекулярная
характеристика корень специфичных промоторов из
MIC-3
межгенного
региона и создание генетических конструкций с корень специфичным
промотором для достижения корень специфичной экспрессии
» говорится
о создании векторной конструкции с помощью синтетических РНК
дуплексов и нуклеотидной последовательности минимальной длины корень
спецефичного промотора гена
MIC-3
, полезных в будущем для
биотехнологии хлопчатника.
Исследования имеют следующие результаты:
2.5 кb межгенные регионы
MIC-3
генного кластера были амплифицированы,
42
Рисунок 3
.
Паттерн дупликации генов в семействе
MIC-3
генов
диплоидных и аллотетраплоидных видов
Gossypium
:
(A) диплоидные виды: Gherb –
G. herbaceum
, Glong –
G. longicalyx
, Grai –
G. raimondii
; (B)
– аллотетраплоидные виды: Gh_TM1 –
G. hirsutum
TM-1, GB-379 –
G. barbadense
Pima
3-79; Gmust–
G. mustelinum
, и Gtom–
G. tomentosum
.
Примечание
: другие генотипы
G.
hirsutum
(Sisoline, M315, Clevewilt, M240, ST213, Голиб, M8 и REDM), использованные
в этом исследовании, имели те же паттерны генной дупликации, они не включены для
простоты рисунка, оценки времени дивергенции (MYA) были рассчитаны с
использованием коэффициентов синонимичных замен в парах членов
MIC-3
гена на
генотип / вид с использованием 2,6 х 10
-9
синонимичных замен на сайт / год.
клонированы и секвенированы с использованием праймерных пар из первого
экзона
MIC-3
генов. Была использована консенсусная позиция 220-240 п.о.
(прямого)
и
130-154
(обратного)
множественного
выравнивания
последовательностей. Анализ этой межгенной
MIC-3
последовательности
позволил идентифицировать характеристики последовательности промотора
с ТАТА-боксом и множественные различные мотивы последовательности,
связанные с корневой специфичностью и патогеном. Несколько пар
праймеров было разработанно для амплификации различных фрагментов
этого 2,5 т.п.о. промоторной последовательности.
Это позволило идентифицировать минимальный промоторный регион.
Рассчитанные пары праймеров имеют рестрикционные сайты на своих
концах для вставки в предварительный двоичный плазмидный вектор,
содержащий
GUS
-репортерный ген. Вкратце, фрагмент промотора
MIC-3
2562 п.о., охарактеризованный в данной работе, был вновь амплифицирован
с парой праймеров, несущих Hind III, а также BamHI адаптеры сайтов
рестрикции. Укороченные фрагменты промотора с различными длинами
43
5'-концевых делеций были аналогичным образом амплифицированы с
каждой конкретной парой праймеров (рисунок 4). Эти промоторные
фрагменты были встроены в общедоступный вектор pBI101, до
GUS
- гена
кодирующего региона, в результате чего получена серия
pBI101-MIC3_Pr::GUS бинарных векторов, а именно: Р-2500 (-2500 / -1, 2500
п.о.), P-2200 (-2200 / -1, 2200 п.о.), P-1800 (-1882 / -1, 1882 п.о.), P-1600 (-1658
/ -1, 1658 п.о.), P-1300 (-1381 / -1, 1381 п.о.), P-1000 (-1057 / -1, 1057 п.о.),
P-700 (-708 / -1, 708 п.о.). Этивекторы были перенесены в штамм LBA4404
(для преобразованияхлопчатника) или GV3101 (для трансформации
арабидопсиса)
Agrobacterium tumefaciens
и использован для
in planta
трансформации
Arabidopsis
. Трансгенные растения отбирали, высевая на
канамицин-содержащие чашки сагаром. Трансгенные растения
Arabidopsis
,
имеющие минимальный вектор промоторной области, pBI101-700::GUS,
показал экспрессию
GUS
только в корне растения, как показано
определением
GUS
при выращивании на агаре (рисунок 4). Это позволило
предположить, что минимальная область промотора
MIC-3
в 708 п.о.
достаточна, чтобы направить экспрессию любого гена к корням растения.
При помощи этих
MIC-3
векторов были преобразованы в общей сложности
1383 гипокотиля Кокер-312, включая без векторные преобразования.
Рисунок 4.Верификация функций
MIC-3
промотора:
A – фрагментированные последовательности
MIC-3
промотора [1,9 – маркер λ/HindIII, 2
Pr-2500, 3 Pr-2200, 4 Pr-1882, 5 Pr-1381, 6 Pr-1057, 7 Pr-708, 8 Pr-1658]; B и C – суб
клонирование в pBI101 бинарный вектор с GUS маркерным геном; гистохимическое
окрашивание экспрессируемых
GUS
паттернов в трансгенных растениях
Arabidopsis
,
экспрессирующих P-700::GUS: (D) 1 – недельные траснформированные проростки; (E)
контрольные растения
Arabidopsis
.
44
В качестве отрицательного контроля 125 гипокотилей обрабатывали водой.
Некоторые трансгенные эмбрионы растений хлопчатника, несущие
промоторные области
MIC-3
гена, перенаправляющие функционирование
маркерного гена
GUS
, были соматически регенерированы (рисунок 5) для
дальнейшей характеристики на молекулярном и функциональном уровне.
Этот уникальный корневой промотор будет полезен для биотехнологии
растений в целях экспрессии любого гена только в корнях растений. Также,
были сконструированы и оптимизированы основы бинарных векторов
содержащие РНК дуплексы растительных генов, для изучения функции
растительных генов, включая
MIC-3
гены.
Рисунок 5. Трансформация хлопчатника и соматический эмбриогенез с
использованием
MIC-3
специфичных промоторных конструкций:
A –
участки гипокотиля; B – каллусогенез; C – соматически регенерированные эмбриоды; D –
укоренение и проращивание; E – перенос в почву в горшках.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основе проведѐнных исследований по докторской диссертации на
тему «Клонирование, характеристика семейства генов
MIC-3,
определяющих
устойчивость к патогенам хлопчатника (
Gossypium
spp.) и изучение их
молекулярной эволюции, а также значение этих генов в биотехнологии»
представлены следующие выводы:
1. Впервые клонированы, секвенированы и выявлены положение,
структура и содержание комплексного, крупного, специфичного только для
хлопчатника, и экспрессируемого в корне семейства генов
MIC-3
у
аллотетраплоидных и диплоидных видов
Gossypium
.
2. 169 последовательностей геномной ДНК членов
MIC-3
генов из 15
генотипов хлопчатника состоят из 4 до 16 членов гена из 2-10 подсемейств на
каждый генотип/вид.
3. Все члены
MIC-3
генов с использованием нуклеотидных
45
полиморфизмов (SNP) и предполагаемых гаплотипов были филогенетически
сгруппированы в 17 геномно специфических подсемейств. 4. Рекомендуется
использование 42 гаплотипных последовательностей, полученных в
результате анализа членов
MIC-3
гена из аллотетраплоидного A
t
- или D
t
-
геномов для определения специфичных для гена
MIC-3
SNP полиморфизмов.
5. Впервые были разработаны
MIC-3
геном-специфичные SNP маркеры
и с использованием гаплотипических ассоциаций и экспериментов с
длинными ПЦР была доказана кластерная локализация членов
MIC-3
гена в
гомеологичных сегментах хромосом 4 и 19 у
G. hirsutum.
6. Впервые были определены скорости нуклеотидных замен и паттерны
молекулярной
эволюции
мульти-генного
семейства
MIC-3
в
15
тетраплоидных и диплоидных генотипах хлопчатника. Оценкой среднего
числа синонимичных (d
S
) и несинонимичных (d
N
) нуклеотидных замен для
кодирующих последовательностей ДНК семейства
MIC-3
генов выявлены
селекционные ограничения и молекулярная эволюция семейства этого гена в
геноме хлопчатника.
7. Гены
MIC-3
эволюцинируют в соответствии с моделью «рождения и
смерти» под влиянием изолирующего отбора в экзоне-1 и дивергентной
селекции в экзоне-2, хотя в начале молекулярной эволюции происходила
стабилизирующая «совместная» эволюция.
8. Результаты также поясняют наличие «амплификации гена» как
возможного механизма сохранения всех дублирующих копий
MIC-3
генов и
разработки новых функций генов в процессе защиты хлопчатника в рамках
модели «исчезающей приманки».
9. Прохождение дупликации
MIC-3
генов, один раз за ~1 миллион лет у
аллотетраплоидных геномов, один раз в ~2 миллиона лет у A / F геномов, и
один раз в ~8 миллиона лет у D-геномов, а также выявленная оценка времени
и образец дупликации генов рекомендуется для понимания роли
патоген-опосредованных процессов отбора в эволюции геномов хлопчатника.
10. Высокая экспрессия
MIC-3
генов во время заражения патогенами
Fusarium
и
Verticillium
у устойчивых и неустойчивых генотипов сортов
хлопчатника, ассоциируется сважным значением
MIC-3
генов.
11. Впервые была клонирована и секвенирована нуклеотидная
последовательность, а также охарактеризованы промоторные мотивы
межгенного спейсерного региона длиной 2,5 kb, содержащего в себе
MIC-3
промотор с сигнальной корень-специфичной последовательностью.
12. Созданы и трансформированы бинарные генетические векторы с
минимальной нуклеотидной последовательностью промотора корень
спецефичного
MIC-3
гена, содержащего синтетические РНК дуплексы,
которые рекомендуются для биотехнологии растений.
46
ONCE-ONLY SCIENTIFIC COUNCIL FOR AWARDING THE
SCIENTIFIC DEGREE OF DOCTOR OF SCIENCES NO.14.07.2016.В.15.01
AT THE INSTITUTE OF GENE POOL OF PLANTS AND ANIMALS, THE
NATIONAL UNIVERSITY OF UZBEKISTAN, THE INSTITUTE OF
GENETICS AND EXPERIMENTAL BIOLOGY OF PLANTS
CENTRE OF GENOMICS AND BIOINFORMATICS
BURIEV ZABARDAST TOJIBAEVICH
CLONING, CHARACTERIZATION AND INVESTIGATION OF
MOLECULAR EVOLUTION OF PATHOGEN- RESISTANCE CLUSTER
MIC-3
GENE FAMILY IN COTTON (
GOSSYPIUM
SSP.) AND ITS
SIGNIFICANCE FOR COTTON BIOTECHNOLOGY
03.00.14 – Genomics, proteomics and bioinformatics
(biological sciences)
ABSTRACT OF DOCTORAL DISSERTATION
TASHKENT – 2016
47
The theme of the doctoral dissertation is registered by the Supreme Attestation Commission
at the Cabinet of Ministers of the Republic of Uzbekistan under number 14.07.2016/В2016.3.В174.
The doctoral dissertation has been carried out at the Centre of Genomics and Bioinformatics.
The abstract of the dissertation is posted in three languages (Uzbek, Russian and English) on the
webpage of the Scientific Council (www.flora_fauna.uz) and on the website of “ZiyoNET” information
and education portal (www.ziyonet.uz).
Scientific consultant: Abdurakhmonov Ibrokhim Yulchievich
Doctor of
Biological Sciences, Professor
Official opponents: Mukhammedov Rustam Sultanovich
Doctor of Biological
Sciences, Professor
Turdikulova Shakhlokhon Utkurovna
Doctor of Biological Sciences
Rizaeva Sofiya Mamedovna
Doctor of Biological Sciences, Professor
Leading organization: Institute of Microbiology
The defence of the dissertation will be held on “___”____________2016 at ____ at the meeting of
the once only Scientific Council No.14.07.2016.B.15.01 at the Institute of Gene Pool of Plants and
Animals, the National University of Uzbekistan, the Institute of Genetics and Experimental Biology of
Plants (Address: 232 Bogishamol str., Таshkent, 100053, Uzbekistan. Conference hall of the Palace of the
Institute of Gene Pool of Plants and Animals. Теl.: (+99871) 289-04-65; Fax (+99871) 262-79-38; e-mail:
igppa@academy.uz.).
The doctoral dissertation can be looked through in Information Resource Centre of the Institute of
Gene Pool of Plants and Animals (registered with No.___). Address: 232 Bogishamol str., 100053,
Tashkent. Tel.: (+99871) 289-04-65.
The abstract of the dissertation is distributed on “___” _____________2016.
(Registry record no.___dated “____” _______________2016)
К.Sh.Tojibaev
Chairman of the Scientific Council on Award of
Scientific Degree of Doctor of Sciences, D.B.S.
B.A. Adilov
Scientific Secretary of the Scientific Council
on Award of Scientific Degree of Doctor of
Sciences, Ph.D, senior researcher
Sh.Yunuskhonov
Chairman of the Scientific Seminar of the
Scientific Council on Award of Scientific
Degree of Doctor of Sciences, D.B.S., Professor
48
INTRODUCTION (annotation of doctoral dissertation)
Topicality and relevance of the theme of the dissertation.
Due to the
globalization, there are urgently pressing concerns for world agricultural
production to provide bio-safety/bio-security of the world’s leading crop species
and safeguarding them from biotic (phytopathogens, pests) threats. “Biological
threats from harmful organisms in agricultural practice cost over $1.4 trillion in
crop damage, equaling 5% of global domestic product (GDP)”
1
.
During the years of independence, in our country extensive work has been
done to improve crop yields, and today agricultural production is part of the
country’s annual economic income. At the same time reforms in the cotton sector
are being carried out and certain results obtained on the basis of held program
measures, i.e. areas of cotton crops were reduced, and yields have been increased
by an average of 3-4 quintals.
World cotton production suffers from wilt diseases (
Fusarium
and
Verticillium
) and root-knot (
Meloidogyne incognita
; RKN) nematodes. RKN
accounts for an estimated 14% of all worldwide plant losses, which is reflected in
the amount of about $100 billion dollars annually. “The significant cotton yield lost
in the USA during the last 10 years of period because of RKN estimated to be
about $205 million annually”
2
. The actuality of the problem in this context,
together with fighting wilt pathogens, is to study and develop modern
biotechnology tools against biological vectors conditioning to spread wilt diseases
in cotton. Conducting research on the genetic basis of nematode managment is
justified as follows: need to identify genes conferring resistance to pathogens in
cotton; study their structure and composition in the cotton genome; determining the
location on the chromosomes; study of modern biotechnology and genomics
approaches for creation of lines resistant to pathogens.
This dissertation investigation serves to some extent to address the tasks
defined by the Law of the Republic of Uzbekistan No 116-II “On protection of
agricultural plants against pests, diseases and weeds” of 31 August, 2000, the
Resolution No.148 of the Cabinet of Ministers of the Republic of Uzbekistan “On
measures of improving the structure and increasing the efficiency of plant
protection service” issued on March 29, 2004 as well as other legal documents
approved in this direction.
Relevance of the research to the priority areas of science and technology
development of the Republic
. This research was carried out according to the
priority directions of science and technology development of Uzbekistan in “V:
Agriculture, biotechnology, ecology and environmental protection”.
Review of international researches on the topic of the dissertation.
The
molecular-genetic basis of disease resistance of
Gossypium
genus, in particular,
resistance against nematode pests were studied by scientist and research groups of
the leading research centres and higher educational institutions of the world,
including Texas A&M University (USA), Mississippi State University (USA),
1
http://www.fao.org/docrep/018/i3300e/i3300e.pdf.
2
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNematode.aspx
49
University of California (USA), University of Georgia (USA), and United States
Department of Agriculture (USDA) of the USA, Plant Industry (Australia),
Northeast Institute of Geography and Agroecology (China) as well The Centre of
genomics and bioinformatics (Uzbekistan).
As a result of the researches carried out in the world on the molecular-genetic
study of cotton (
Gossypium
spp.) resistance to pathogens, a number of scientific
results have been obtained: there were revealed a connection between wilt disease
and nematode infection, threat of nematode-wilt disease complex, as well as
several DNA markers associated with this disease (University of California, USA);
using microsatellite markers the researchers of United States Department of
Agriculture (USA) have mapped RKN resistance QTLs on chromosomes 11 and
14 of Upland cotton; using a large number of DNA markers (SSR and AFLP) and
screening an additional 1221 F
2
individuals of genetic population for RKN
resistance the researchers from University of Georgia (USA) have identified the
Mi-C11 Mi-C14 loci.
In the world, the following studies on the molecular-genetic study of the
cotton (
Gossypium
spp.) resistance to pathogens (including the below mentioned
priority areas) are being carried out: identification of new genes of resistance to
pathogens; QTL mapping by DNA markers; determination of chromosomal
location of genes of resistance to pathogens; obtaining new biotechnological
cultivars resistant to pathogens.
The degree of study of the problem.
Most of known resistance-associated
multi-gene clusters in plants were studied by foreign scientists – DeYoung B.J. et
al
3
.; He L. et al.
4
characterized and mapped the NBS-LRR protein encoding
resistance genes in allotetraploid cotton; Zhang X. D. et al.
5
and Callahan F. E. et
al.
6
, identified high expression of a unique root-specific cotton
MIC-3
protein in
root-knot nematode (RKN) resistant plants during nematode infection; Wubben M.
et al.
7
showed that
MIC-3
multi-gene family not associated with any specific
resistant motifs or NBS-LRR like domains; identified the preliminary functional
features of the
MIC-3
gene family during plant defense response and showed that it
is independent of other well-known defense pathways.
In Uzbekistan, a genetic study of upland cotton crop “Golib” resistant to
nematodes, was carried out by H. Kholmatov, Sh. Egamberdiev comprehensively
has identified the pathogens of
Fusarium
genus by molecular genetic methods, and
3
DeYoung BJ, Innes RW. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense. Nat Immunol. 2006 Dec;7
(12):1243-9.
4
He L., Du C., Covaleda L., Xu Z., Robinson F.A., Yu J.Z., Kohel R.J., Zhang H.B. Cloning, characterization, and
evolution of the NBS-LLR-encoding resistance gene analogue family in polyploid cotton (
G. hirsutum
L.) // Mol
Plant Microbe Interact. 2004. 17:1234-1241.
5
Zhang X.D., Callahan F.E., Jenkins J.N., Ma D-P., Karaca M., Saha S., Creech R.G. A novel root-specific gene,
MIC-3
with increased expression in nematode-resistant cotton (
G. hirsutum
L.) after root-knot nematode infection //
Biochim.Biophys.Acta. 2002. 1576:214-218.
6
Callahan F.E. Zhang X-D., Ma D-P., Jenkins J.N., Hayes R.W., Tucker M.L. Comparison of
MIC-3
protein
accumulation in response to root-knot nematode infection in cotton lines displaying a range of resistance levels // J
Cotton Sci. – USA, 2004. 8:186-190.
7
Wubben M.J., Callahan F.E., Hayes R.W., Jenkins J.N. Molecular characterization and temporal expression analyses
indicate that the
MIC
(
Meloidogyne-induced cotton
) gene family represents a novel group of root-specific
defense-related genes in upland cotton (
G. hirsutum
L.) // Planta. 2008. 228:111-123.
50
also was studied the pathogenic properties of pathogens species and races,
occurring more often in relation to the local cotton varieties. However, clustered
supergenes for disease resistance in cotton have not yet been studied in detail in
both national and international levels. Currently, with the scientific and practical
point of view it is very important to study the molecular evolution and
characteristics of the clustered family of
MIC-3
genes which determine the
resistance to pathogens in cotton (
Gossypium
spp.) as well as the application of
these genes in biotechnology.
Connection of the theme of dissertation with the scientific-research works
of the higher educational institution, where the dissertation is conducted.
The
dissertation research has been done in the Centre of Genomics and Bioinformatics
in accordance within the framework of fundamental, applied and international
projects: F4-T149 “Investigation of the structure and function of cotton genome for
the development of marker-assisted selection” (2007-2011); UZB2-31017-TA-09
“Evaluation of potential germplasm resistance against root-knot nematode and
Fusarium wilt diseases in cotton and development of SNP-based candidate gene
markers” (2009-2013); “Obtaining high quality cotton transgenic lines using
genetic binary vectors based on synthetic duplex RNAi established for cotton
genes” (2009-2011).
The aim of the research
is to determine
MIC-3
gene position, structure,
content, and complexities as well as molecular evolution and gene duplication
mechanisms in allotetraploid and putative ancestor-like diploid cotton genomes.
The main tasks of the study:
cloning and sequencing all members of
MIC-3
genes from major putative
ancestor-like diploid and allotetraploid genomes of
Gossypium
species; performing
a detailed phylogenetic analysis and classification of
MIC-3
genes into
sub-families in
Gossypium
species;
discovering the putative haplotypes of
MIC-3
sequences in cotton genome and
developing the SNP markers to confirm clustered localizations of
MIC-3
gene
members on specific cotton chromosomes useful for future marker-assisted
selection programs;
characterizing putative protein sequences and nucleotide substitution rates to
study patterns and rates of molecular evolution, gene duplication, and maintenance
mechanisms of
MIC-3
multi-gene family before and after allopolyploidization in
cotton genome;
studying cotton genome evolution based on
MIC-3
gene information and
re-estimate the divergence times of
Gossypium
genomes;
studying adaptive selection patterns based on “synonymous” and
“nonsynonymous” substitution rates contributing to nematode and disease
resistance;
studying
MIC-3
gene expression during
Fusiarium
and
Verticillium
wilt
infection process in susceptible and resistant genotypes of cotton cultivars;
determining the intergenic spacer regions between several
MIC-3
genes and on
their basis constructing binary vectors containing minimal promoter region, and
transforming them into model plant Arabidopsis to identify promoter sequences
51
useful for future cotton and plant biotechnology;
constructing and optimizing binary vectors bearing synthetic RNAi duplexes
to study the function of plant genes including
MIC-3
.
The objects of the research.
Plant materials used were doubled-haploid line
Pima 3-79 of
G. barbadense
([AD]
2
-genome),
G. tomentosum
([AD]
3
-genome),
G. mustelinum
([AD]
4
-genome), and nine genotypes of
G. hirsutum
([AD]
1
-
genome), including Clevewilt, M240, M315, Golib, ST213, M8, Texas Marker-1
(TM-1), susceptible isoline (Sisoline), and red mutant line (REDM). Three of the
diploids included in this study were
G. herbaceum
(A
1
-genome) and
G. raimondii
(D
5
-genome), the genomes of which are most closely related to the
A
t
- (A-subgenome) and D
t –
(D-subgenome) genomes of the extant AD tetraploid
species, and the F-genome African wild cotton,
G. longicalyx.
We used deficiency
testing to delimit chromosomal locations of
MIC-3
genes, by screening
polymorphisms against a set of monosomic and monotelodisomic interspecific
G. hirsutum
x
G. barbadense
F
1
hybrids and analogous primary monosomic F
1
hybrids
G. hirsutum
x
G. mustelinum.
The subject of the research
is the unique disease resistance
MIC-3
gene
family from 15 tetraploid and diploid cotton genotypes.
The methods of the research work.
In this work, all basic molecular biology
methods including DNA isolation, gene sequencing and cloning, genetic structure
analyses, phylogenetic clustering, tests for recombination and gene conversions,
molecular evolution divergence times as well as marker development, binary
vector constructions and genetic transformation methods as well as modern
bioinformatics and statistical tests were applied.
Scientific novelty of the research
includes the following:
for the first time, a total of 169 individual members belonging to
MIC-3
supergene family from 15 allotetraploid and diploid genomes were cloned,
sequenced and characterized;
a detailed sequence analysis of 169
MIC-3
gene found out that in 15 cotton
genotypes were detected 4 to 16 gene members with 2 to 10 subfamilies per
genotype/species. These 169
MIC-3
gene sequences from
Gossypium
species were
phylogenetically grouped into a total of 17 genome-specific subfamilies;
analysis of allotetraploid genome-derived
MIC-3
gene members further
identified 42 haplotype sequences, specific to A
t
- or D
t
-genomes, that helped to
identify
MIC-3
gene specific SNPs. Based on haplotype and subfamily groups, 9
putative
MIC-3
loci in A
t
-genome and 3 putative loci in D
t
-genome of
allotetraploid cottons were identified;
for the first time,
MIC-3
derived genome specific SNP markers were
developed, and clustered localizations of
MIC-3
gene members in homeologous
segments of chromosomes 4 and 19 of
G. hirsutum
were identified;
for the first time, nucleotide substitution rates and patterns of molecular
evolution of
MIC-3
multi-gene family in 15 tetraploid and diploid cotton
genotypes were reported.
estimation of an average number of synonymous (d
S
) and nonsynonymous
(d
N
) nucleotide substitutions for coding DNA sequences of
MIC-3
gene family
52
detected that despite an early-course concerted evolution may be evident,
MIC-3
gene family of cotton species are evolving under a “birth-and-death” evolution
with purifying selection in exon-1 and diversifying selection in exon-2.
for the first time “gene amplification” was suggested as a possible mechanism
to preserve all duplicated copies of
MIC-3
genes and to develop new gene
functions during cotton plant defenses under “bait and switch” model.
the results indicated that
MIC-3
gene duplication events occurred at various
rates, once per 1 million years (MY) in the allotetraploids, once per ~2 MY in the
A/F genome clade, and once per ~8 MY in the D-genome clade;
expression analysis detected that
MIC-3
genes are highly expressed in
Fusiarium
and
Verticillium
wilt resistant cotton genotypes;
for the first time, 2.5 kb intergenic spacer region, containing a
MIC-3
promoter with root-specific signal sequence were cloned, sequenced and
characterized.
Practical results of the research:
MIC-3
gene sequences are recommended for modern cotton breeding and
biotechnology programs to develop wilt and nematode resistant as well as other
pathogen-related diseases of cotton;
SNP markers developed for
MIC-3
genes are recommended for marker
assisted selection (MAS) of cotton to develop new cotton cultivars; several genetic
binary vectors consisting of
GUS
marker gene with the promoter sequences of
MIC-3
gene have been made and the vectors are transformed into the model plant
Arabidopsis
. A minimal root-specific promoter of
MIC-3
gene, which is very
useful in plant biotechnology, is recommended; synthetic RNAi vector constructs
used in the study of gene activity in plant biotechnology have been created, new
lines of cotton biotechnology have been obtained.
The reliability of the obtained results
is confirmed by the use of modern
approaches and methods. The data have been processed and analyzed using
classical statistical tools such as analysis of variance (ANOVA), analysis of
molecular variance (AMOVA), and Wilcoxon matched pairs signed-rank test,
modern sequence analysis (Sequencher, ClustalX, Mega 4.1, BLASTX)
algorithms, phylogenetic analysis methods (UPGMA, Mega 4.1, NJ), gene
conversion and recombination tests (GeneConv, DNASP, RDP3, SiScan), and
substitution rate (KaKs with Juke-Cantor corrections; codon-based Z-tests)
analyses. The number of synonymous substitutions per site per year for
MIC-3
genes of cotton genomes were calculated using the expression r= Ks/2T.
Theoretical and practical significance of the research results.
The
scientific significance of the research results are interpreted by providing novel
knowledge, understanding, and the detailed account of molecular evolution,
selective forces. For the first time, we discovered “gene amplification” and
mechanisms that retain all duplicate copies of
MIC-3
genes in diploid and
tetraploid cotton species, and occurrence of new gene functions during plant
defenses in cotton under “bait and switch” model.
The practical significance of the work is that the
MIC-3
derived SNP markers
53
and
MIC-3
sequences evolving under positive selection providing increased
disease resistance for cotton can be used for modern MAS programs to develop
nematode and wilt resistant varieties,
MIC-3
gene promoter can be effectively used
to redirect any gene function to plant roots including cotton that will provide safety
of many transgenic events, and developed synthetic RNAi constructions are used
in gene activity study.
Implementation of the research results.
In response to the study of
molecular evolution and characteristics of the clustered family of
MIC-3
genes as
well as on the basis of the results obtained under the use of these genes in
biotechnology of cotton:
patents for the invention (12.01.2011, № IAP 04300; 02.06.2011, № IAP
04383; 23.05.2011, № IAP 04360; 23.05.2011, № IAP 04361) on the method of
small interfering RNA (siRNA) for suppression of gene expression in plant cells
have been obtained from the Intelligent Agency of the Uzbekistan Republic. The
results of the scientific research have allowed to create new lines by transforming
the vector constructs of plant biotechnology genes, for example, by studying the
activity of
MIC-3
gene;
clustered
MIC-3
genes have been used in the project № 6064-21000-014-00-
D “The genetic improvement of cotton by using marker-associated and traditional
breeding and introgression of genes from exotic
Gossypium
species” (2013-2018),
funded by the US Department of Agriculture (reference United States Department
of Agriculture of 26 September 2016). By using clustered
MIC-3
genes the
possibility of obtaining nematode resistant lines, as well as improving the cotton
resistance to pathogens has been created;
Testing of the research results.
Basic results of the research were presented
in the form of lectures, and were approved at 13 international and local scientific
conferences including “Conference of American Society of Agronomy” (New
York, 2006), “Actual problems of molecular biology of plants” (Tashkent, 2008),
“World genetic diversity of cotton is the basis of basic and applied projects”
(Tashkent, 2010), “Biology – the Science of the 21st Century” (Pushino, 2010),
“Actual problems of development of bioorganic chemistry” (Tashkent, 2010),
“International Cotton Genome Initiative сonference” (Canberra, 2010), “5
th
World
cotton Research Conference” (Mumbai, 2011), “International Cotton Genome
Initiative (ICGI) Conference” (Brasilia, 2006; Raleigh, 2012), “International
Cotton Conference” (Bremen, 2014), “Modern problems of genetics, genomics and
biotechnology” (Tashkent, 2016).
Publication of the research results.
A total of 28 scientific works were
published on the theme of the dissertation. Of these 10 scientific articles were
published in the journals recommended by the Supreme Attestation Commission of
the Republic of Uzbekistan for publishing basic scientific results of doctoral
dissertations, including 5 national and 5 international journals. In addition, 4
patents related to the methods used in this work were received.
The structure and volume of the dissertation.
The dissertation consists of
an introduction, five chapters, a conclusion and a list of references. The size of the
dissertation is 171 pages.
54
THE MAIN CONTENT OF THE DISSERTATION
In the introduction
the topicality and relevance of the dissertation theme
were justified. The aims and objectives, the objects and subject of the dissertation
were formulated; and its conformity to the priority directions of science and
technology development of the Republic was shown. The scientific novelty and the
practical results of the study were set out, the reliability of the obtained results was
proved and their theoretical and practical significance were discussed. A summary
of the application of the research results and the structure of the dissertation were
given.
In the second chapter of the dissertation titled
“Materials, conditions and
methods of investigation of clustered genes of cotton”,
the detailed descriptions
of plant materials and used reagents, methods of DNA isolation, cloning,
sequencing, and sequence analyses using phylogenetic, haplotyping, gene
conversion, recombination, and molecular evolutionary tests with application
modern statistical approaches were given.
In the third chapter of the dissertation titled
“Characterization and
chromosomal localization of
MIC-3
genes of
Gossypium
species”,
the
composition, structure and location of the gene family MIC-3 were investigated, as
well as allotetraploid and diploid genomes of cotton were cloned, sequenced and
characterized.
The studies include the following results:
Approximately, 150 individual PCR-derived clonal inserts for
MIC-3
gene
products were sequenced from each of 15 cotton genotypes. The amplicons from
MIC-3
genes of
Gossypium
species ranged from 653-706 bp, including 653-706 bp
amplicon length in all allotetraploid genotypes, 703-713 bp amplicons in
G.
herbaceum
, 653-691 bp amplicons in
G. raimondii
, and 706 bp long amplicons in
G. longicalyx
(Table 1).
Multiple sequence alignment formed 721 bp long
MIC-3
full-length
consensus genomic sequences for all
Gossypium
species studied. Intronic and
exonic parts of the
MIC-3
genes of
Gossypium
species were annotated according to
MIC-3
nucleotide and protein sequence (Zhang et al., 2002).
Multiple sequence alignment of the genomic sequences from all
Gossypium
species in our study demonstrated that our sequences corresponded to 11 bp from
non-coding 5’UTR region, two coding regions of 221-230 bp (exon 1) and 193 bp
(exon 2), single noncoding intronic region of 65-77 bp, and noncoding 3’ UTR
region of 151-195bp of
MIC-3
gene. The variations were due to large insertion and
deletion (indel) changes observed in some members of
MIC-3
gene family in each
studied cotton genotype. For example, all the studied cotton genotypes, except
G.
herbaceum
(A- genome), had the 9 bp D-genome specific indel in the first exon. It
is interesting to note that there was the occurrence of a triplet position shifting
toward upstream direction in 9 bp indel within A-genome grouped (according SNP
mutation, see phylogenetic grouping) on
MIC-3
amplicons of
G. mustelinum
(Table 1).
55
Table 1
Characteristics of
MIC-3
gene family of
Gossypium
species
Genotype
Number of
members
Amplicon length
variation
Indel changes
Total
SNP
exon 1 intron
3'
UTR
Gh_TM1
10
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Sisoline
11
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_ST213
11
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
16 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_M8
12
697 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
-
-
17 (A
t
),
20 (D
t
)
Gh_REDM
13
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_Golib
16
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15.29
15
-
21 (A
t
),
22 (D
t
)
Gh_Clevewilt
13
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
17 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M240
9
653 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
16 (A
t
),
21 (D
t
)
Gh_M315
15
653 (D
t
)
697 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15.29
-
-
18 (A
t
),
27 (D
t
)
Gb_3-79
11
653 (D
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
,D
t
)
9
9
-
-
-
-
15.29
15
11 (A
t
),
29 (D
t
)
G. tomentosum
9
653 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
-
-
-
15.29
-
10 (A
t
),
24 (D
t
)
G. mustelinum
15
653 (D
t
)
668 (A
t
)
682 (D
t
)
706 (A
t
, D
t
)
9
9*
9
-
-
-
-
-
15.29
29
15
-
12 (A
t
),
28 (D
t
)
G. herbaceum
9
703
707
709
713
-
-
-
-
12
8
6
8
6
6
6
-
19 (A)
G. raimondii
4
651
653
691
9
9
-
-
-
-
31
29
-
33 (D)
G. longicalyx
11
706
-
-
-
14 (F)
*Note:
9 bp indel in the first exon of A
t
-genome specific
MIC-3
gene amplicon of
G.
mustelinum
has a triplet upstream shift compared to other D
t
-genome specific indels observed in
other genotypes. Gh –
G. hirsutum
; Gb –
G. barbadense
.
Moreover, all allotetraploid lineages, except
G. hirsutum
cv. M8, had two
other major indels of 15 bp and 29 bp found in 3’UTR region, of which 29 bp indel
(both structure and position wise) shared with the putative D-genome ancestor to
allotetraploids,
G. raimondii
. The 15 bp indel was unique to only allotetraploid
56
genotypes studied and were not shared with either A- or D-genome putative
diploid ancestors. Studying the indel pattern in 3’UTR of
MIC-3
amplicons of AD
cottons (Table 1), more complex amplicons, with the combination of 15 and 29 bp
indel, were found in
G. mustelinum
(three different types), and
G. barbadense
Pima
3-79 (two types) and
G. hirsutum
cv. Golib (two types). In that,
G. barbadense
Pima 3-79 and
G. hirsutum
cv. Golib
MIC-3
indel patterns were similar where
occurrence of amplicons with 15 bpindel alone were unique to these genotypes,
suggesting introgression between
G. barbadense
and Golib lines. On the other
hand, either 15 or 29 bp indels in 3’UTR of any of
MIC-3
members of the
G.
hirsutum
cv. M8 among all clones were not found. Only 12
MIC-3
gene members
were detected in M8. Wubben (2008) reported 15 distinct members from the same
M8 genotype. It could be due to missing of some of
MIC-3
members in
PCR-cloning experiment of this work.
169 gene members were grouped into 17 different sub-families in the
phylogram (Figure 1). One hundred and ten members of
G. hirsutum
genotypes
were grouped into 12 sub-families, out of which subfamilies 1 to 9 were specific to
A
t
-genome and 10 to 12 were specific to D
t
-genome (Figure 1). Subfamilies 13 and
14 were specific to
G. herbaceum
, subfamily 15 was specific to
G. longicalyx
, and
subfamilies 16 and 17 were specific to
G. raimondii MIC-3
gene family. All
allotetraploid
MIC-3
gene members, except one of
G. mustelinum
-derived member
(
MIC-3
_14), were clustered within 12 sub-families of
G. hirsutum
(Figure 1).
However,
MIC-3
_14 was clustered within the 13th subfamily found in A-genome.
Both
G. herbaceum
and
G. raimondii
, the putative A- and D-genome ancestors to
AD cottons, had two distinct subfamilies. Species-specific presence of some sub
families was observed. For example, subfamily 1 was found only in
G. hirsutum
including susceptible isoline (Sisoline), ST213, and Clevewilt, sub-family 8
included sequences of M315, and subfamily 11 contained sequences of M8 and
M315 upland cultivars.
To identify haplotypes of
MIC-3
genes in tetraploid cotton,
G. hirsutum
derived
NJ phylogram of
MIC-3
genes were used because of wide representation of
a diverse group of lines from this species in this study.
G. hirsutum
(AD)
haplotypes were broadly divided into two putative broad groups: 1) A
t
-genome
haplotypes and 2) D
t
-genome haplotype according to clustering with respective
putative diploid ancestors,
G. herbaceum
and
G. raimondii
. The consensus
sequences of
G. herbaceum
and
G. raimondii
were used as the reference sequence
in the haplotype tables (see the dissertation). Consistent with subfamily
classifications of
MIC-3
genes in
G. hirsutum
(see above), the results showed that
At-genome had 9 putative loci (haplotype group) with an average of 3.5 allele or
haplotype/ locus, and D
t
-genome consisted of 3 putative loci (haplotype groups)
with an average of 3.3 putative alleles or haplotypes/locus in
G. hirsutum
. The
number of haplotypes or putative alleles per putative locus ranged from 2-6 in
A
t
-genome and 4-6 in D
t
-genome. The tetraploid
MIC-3
sequences included 25
SNPs in the A
t
-genome and 26 SNPs in the D
t
-genome, all biallelic, except
positions 113 (A, D), 162 (D) and 568 (D). The average number of bp per SNP in
the A
t
-genome versus
D
t
- genome was 182.6 bp and 108.8 bp, respectively.
57
Figure 1. Curved Neighbour-Joining phylogenetic tree derived from 86 different
MIC-3
genes of
Gossypium
species
:
Bootstrap values (>50%) are shown.
58
According to a separate phylogenetic (Figure 2) and
MIC-3
sequence analyses
of TM-1 (a standard line for
G. hirsutum
) and Pima 3-79 (a double haploid
standard line for
G. barbadense
), several GSP markers were designed to
distinguish the interspecific genomic polymorphisms between these two species.
Figure 2. Curved Neighbour-Joining phylogenetic tree derived from
MIC-3
genes of
G. hirsutum (TM-1), G. barbadense (Pima 3-79
), and two putative
diploid ancestors of AD cottons:
Branch length, bootstrap support values (>50%), chromosomal positions, and genome origins are
shown and colour-coded for simplicity.
These candidate gene markers were then used for deletion analysis by
screening the cytogenetic stocks, including monosomic, monotelodisomic, CS-B,
and NTN hybrids (Stelly et al. 2005; Goutirez et al. 2009). Both parental types of
59
polymorphisms were present in most of the F1 hybrids. However, all of eight TM-1
GSP alleles, representing 7 out of 8 different A
t
-genome-derived
MIC-3
members
of TM-1, were absent from the hypoaneuploid F
1
plants that lacked
G. hirsutum
chromosome-4 (H04 monosomic) or the short arm of chromosome 4 (Te04Lo
monotelodisomic). The euploid disomic chromosome substitution line CS-B04
also lacked the same
G. hirsutum MIC-3
alleles for all of these markers. In
contrast, all of the eight GSP loci were heterozygous in all of the other substitution
lines and in the monotelodisomic F
1
substitution plant (Te04sh) deficient for the
long arm of chromosome-4. The results collectively indicated that 7 out of 8
A
t
-genome
MIC-3
members of TM-1 are in the short arm of chromosome 4,
implying potential evidence for clustered localization of
MIC-3
genes in cotton
genome (Figure 2). Although several D
t
-genome
MIC-3
haplotype specific GSPs
between TM-1 and 3-79 were found, they failed to be polymorphic in deletion
analysis and chromosomal localization experiments. This was due to existence of
overlapping sites within 3-79
MIC-3
members that limited us to differentiate GSP
polymorphisms in cytogenetic stocks. However, the detailed sequence analysis of
G. mustelinum
-derived
MIC-3
members helped to design two different GSP
primers (not polymorphic between TM-1 and Pima 3-79), that were polymorphic
between TM-1 and
G. mustelinum MIC-3
gene members, detecting genotype
specific alleles in deletion analysis. Tertiary monosomic F
1
interspecific hybrids
NTN 12-19 and NTN 10-19 differentially lacked the TM-1 allele specific to this
SNP marker, but not the
G. mustelinum
allele. The NTN 12-19 plant is segmentally
deficient for parts of TM-1 chromosomes 12 and 19, whereas NTN10-19 is
segmentally deficient for parts of the TM-1 chromosomes 10 and 19. Together,
they delimit one of the D
t
-genome
MIC-3
member (MIC_3_10) of TM-1 to
chromosome-19. In contrast, primary monosomic interspecific hybrids H10 and
H12 were deficient for
G. hirsutum
chromosomes 10 and 12, but contained the
TM-1 and
G. mustelinum
GSP
MIC-3
markers.
The result indicated that this D
t
-genome-derived
MIC-3
member is not
located in either of these chromosomes, and further supports the localization to
chromosome-19. The other hypoaneuploid F
1
plants lacked other chromosomes,
but contained both TM-1 and 3-79 alleles for this specific SNP marker. Although a
primary monosomic for chromosome-19 is not yet available for
G. hirsutum
, the
results nevertheless clearly indicate that this D
t
-genome
MIC-3
member is located
in chromosome 19 of
G. hirsutum
.
Gene expression analysis of
MIC-3
genes in a number of wilt pathogen
infected and non-infected cotton genotypes revealed that
MIC-3
genes were highly
overexpressed during
Fusiarium
and
Verticillium
infected tissues and the
overexpression was pronouncedly higher in resistant genotypes (data not shown;
see the dissertation). This data showed the importance of
MIC-3
genes not only in
RKN pathogenesis but also, as a PR-protein, its potential guarding function in wilt
pathogenesis and possibly in other diseases of cotton.
In the fourth chapter of the dissertation titled
“Molecular evolution of
MIC-3
gene family in
Gossypium
species”,
the data on nucleotide exchange rate at 15
tetraploid and diploid cotton genotypes and patterns of molecular evolution of
60
multigene
MIC-3
family were presented.
The studies include the following results:
After removal of intronic and UTR sequence regions from all 169
MIC-3
gene
members, 131 distinctive coding DNA sequences for
MIC-3
gene members from
the 15 cotton genotypes were formed that were further grouped into 56 putatively
protein-coding distinct cDNA sequences. These coding DNA sequences were
successfully aligned to 423 bp multiple sequence alignment using ClustalX that
covers entire coding region of
MIC-3
genes, including the first (231 bp) and
second (192 bp) exons. These 56 distinctive putative cDNA sequences generated
29 distinctively predicted protein sequences in all 15 cotton genotypes.
Collectively, amino acid differences were seen at 42 of 141 amino acid positions
(30%) of putative
MIC-3
protein sequences of
Gossypium
species. There were
more amino acid changes in D
t
-genome-derived putative
MIC-3
proteins compared
to the A
t
-genome-derived protein group. Amino acid changes were less
pronounced in the A
1
-and F-genome group of putative
MIC-3
proteins. In contrast,
there were observed the greatest number of amino acid changes within just 4
putative proteins of D
5
-genome
MIC-3
genes.
Further, molecular evolution of the
MIC-3
gene family was studied based on
the analysis of its variation in 15 tetraploid and diploid
Gossypium
genotypes that
collectively represent seven phylogenetically distinct genomes, which are often
used for evolutionary studies. Synonymous (d
S
) and non-synonymous (d
N
)
nucleotide substitution rates suggest that the second of the two exons of the
MIC-3
genes has been under strong positive selection pressure, while the first exon has
been under strong purifying selection to preserve function (Table 2). Based on
nucleotide substitution rates, we conclude that
MIC-3
genes are evolving by a
“birth-and-death” process under strong purifying selection in exon-1 and
diversifying selection in exon-2 (Table 2). The results suggest that a “gene
amplification” mechanism has helped to retain all duplicate copies of
MIC-3
genes
in the
Gossypium
genomes, which best fits with the “bait and switch” model of R
gene evolution. The data indicate
MIC-3
gene duplication events occurred at
various rates, once per 1 million years (MY) in the allotetraploids, once per ~2 MY
in the A/F genome clade, and once per ~8 MY in the D-genome clade (Figure 3).
Variations in the
MIC-3
gene family seem to reflect evolutionary selection for
increased functional stability (through purifying selection in exon-1), while also
expanding the capacity to develop novel “switch” pockets (through diversifying
selection in exon-2) for responding to diverse pests and pathogens. Such
evolutionary roles are congruent with the hypothesis that members of this unique
resistance gene family provide fitness advantages in
Gossypium
as it combats pests
and pathogens.
The fifth chapter of the dissertation titled
“Molecular characterization of
root specific promoters from
MIC-3
intergenic regions and developind genetic
genetic constructions with root-specific promoters for achieving root specific
expression”
discusses the creation of vector designed using synthetic RNA
duplexes and the nucleotide sequence of a minimum length of root-specific gene
promoter
MIC-3
, which will be useful in the future for cotton biotechnology.
61
Table 2
Average within-genotype nucleotide substitution estimates for
MIC-3
gene family of cotton
Genotypes
Geno
me
A
t
D
t
Total*
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
d
N
d
S
d
N
:d
S
Gh_TM-1
[AD]
1
0.80 2.19 0.37 4.19 4.33 0.97 1.85 2.57 0.72
Gh_Sisoline
[AD]
1
0.69 1.94 0.36 4.19 4.33 0.97 1.56 2.34 0.66
Gh_M315
[AD]
1
0.67 1.89 0.35 2.86 3.49 0.82 1.57 2.38 0.66
Gh_M8
[AD]
1
0.78 1.94 0.40 3.53 3.23
1.09
1.36 2.14 0.64
Gh_Clevewilt
[AD]
1
0.80 1.89 0.42 2.79 2.86 0.98 1.61 2.16 0.74
Gh_Golib
[AD]
1
0.66 2.24 0.30 4.19 4.33 0.97 1.50 2.55 0.59
Gh_M240
[AD]
1
0.76 2.09 0.36 4.19 4.33 0.97 1.67 2.46 0.68
Gh_ST213
[AD]
1
0.58 2.04 0.28 4.19 4.33 0.97 1.37 2.48 0.55
Gh_REDM
[AD]
1
0.97 1.97 0.49 4.04 3.74
1.08
1.51 2.37 0.64
Gb_Pima 3-79
[AD]
2
0.31 1.04 0.30 2.84 2.76
1.03
1.90 1.87
1.02
G. mustelinum
[AD]
4
0.39 0.79 0.49 2.30 2.11
1.09
1.73 1.34
1.29
G. tomentosum
[AD]
3
0.49 0.83 0.60 2.90 2.84
1.02
1.78 1.62
1.10
G. herbaceum
A
1
-
-
-
-
-
-
0.43 0.41
1.05
G. raimondii
D
5
-
-
-
-
-
-
3.70 2.83
1.31
G. longicalyx
F
-
-
-
-
-
-
0.35 2.37 0.15
All
G. hirsutum
[AD]
1
2.06 0.61 0.30 2.79 2.37 0.85 1.32 2.39 0.55
All
Gossypium
species
-
1.90 0.58 0.31 2.57 2.20 0.86 1.80 2.58 0.70
Gh –
G. hirsutum
; Gb –
G. barbadense;
Sisoline – Susceptible isoline; *Total - A
t
and D
t
combination; d
S
-synonymous nucleotide substitution rates; d
N
-non-synonymous nucleotide
substitution rates; d
N
:d
S
is the ratio of the rate of nonsynonymous to synonymous substitution
since divergence of two sequences, which is roughly equal to d
N
:d
S
, the ratio of the numbers of
nonsynonymous to synonymous substitutions.
Note
: that d
N
:d
S
rates greater than 1 shown in
bold faced letters; d
N
and d
S
values have been multiplied by 100x.
The researches have the following results:
A 2.5 Kb intergenic regions of
MIC-3
gene clusters were amplified, cloned
and sequenced using a primer pair from the first exon of
MIC-3
genes. The
consensus position of 220-240 bp (forward) and 130-154 (reverse) of multiple
sequence alignment was used. The analysis of this intergenic
MIC-3
sequence
identified a promoter sequence signatures with TATA-box and many different
sequence motifs related to root-specificity and pathogen infection. Several primer
pairs were designed to amplify different fragments of this 2.5 kb promoter
sequence.
This allowed to identify a minimal promoter region. The designed primer
pairs have a restriction enzyme sites at their ends to be inserted into upstream of
binary plasmid vectors containing a
GUS
reporter gene. Briefly, a 2562 bp
promoter
62
Figure 3. Gene duplication pattern in the
MIC-3
gene family of diploid and
allotetraploid
Gossypium
species:
(A) diploid species: Gherb –
G. herbaceum
, Glong –
G. longicalyx
, Grai –
G. raimondii
; (B) –
allotetraploid species: Gh_TM1 –
G. hirsutum
TM-1, GB-379 –
G. barbadense
Pima 3-79;
Gmust –
G. mustelinum
, and Gtom –
G. tomentosum
. Note: the other
G. hirsutum
genotypes
(Sisoline, M315, Clevewilt, M240, ST213, Golib, M8 and REDM) used in this study have the
same gene duplication pattern; they are not included for simplicity of the figure. Divergence time
estimates (MYA) were calculated using synonymous substitution rates in pairs of
MIC-3
gene
members per genotype/species using 2.6 x 10-9synonymous substitutions per site/year.
fragment of
MIC-3
, characterized through our project, was re-amplified with a pair
of primers carrying an Hind III and a BamHI restriction site adapters. Shorter
promoter fragments with different lengths of 5'-terminal deletions were similarly
amplified with each specific primer pairs (Figure 4). These promoter fragments
were inserted into publicly available pBI101 vector, upstream of
GUS
gene coding
region, resulting in a series of pBI101-MIC3_Pr::GUS binary vectors, namely
P-2500 (-2500/-1, 2500 bp), P-2200 (-2200/-1, 2200 bp), P-1800 (-1882/-1, 1882
bp), P-1600 (-1658/-1, 1658 bp), P-1300 (-1381/-1, 1381 bp), P-1000 (-1057/-1,
1057 bp), P-700 (-708/-1, 708 bp). The vectors were transferred into
Agrobacterium tumefaciens
strain LBA4404 (for cotton transformation) or
GV3101 (for Arabidopsis transformation) and used for
in planta
Arabidopsis
transformation experiments. Transgenic plants were recovered selecting seedlings
on kanamycin
containing agar plates. Transgenic Arabidopsis plants bearing a minimal promoter
region vector, pBI101-700:: GUS, showed
GUS
expression in only root of the plant
when subjected to the
GUS
-assay during the growth in the agar plate (Figure 4).
63
Figure 4.
MIC-3
promoter function verification:
A
–
fragmented
MIC-3
promoter sequences [1,9 – Marker λ/Hind III, 2 Pr-2500, 3 Pr-2200, 4
Pr-1882, 5 Pr-1381, 6 Pr-1057, 7 Pr-708, 8 Pr-1658]; B and C– sub-cloning into pBI101 binary
vector with GUS marker gene; Histochemical staining of GUS expression pattern in transgenic
Arabidopsis plants expressing P-700::GUS: (D) 1-week-old transformed seedling; (E) control
Arabidopsis plants.
This suggested that the 708 bp minimal region of the
MIC-3
promoter will be
sufficient to direct any gene expression to the roots of a plant. These
MIC-3
vector
sets were transformed into a total of 1383 hypocotyl sections of Coker-312,
including no vector transformation sets. As a no vector, negative control, 125
hypocotyl sections were treated with water.
Several transgenic cotton embryo plants were somatically regenerated (Figure
5) that bear
MIC-3
gene promoter regions driving
GUS
marker gene which are
being grown for further characterization in molecular and functional level. This
unique root specific promoter will be useful for plant biotechnology industry to
express any gene in plant roots only. Furthermore, binary vectors with syntetic
RNAi duplexes to study plant gen function, including
MIC-3
genes, were
constructed and optimized to be used in plant biotechnology.
64
Figure 5. Cotton transformation and somatic embryogenesis using
MIC-3
specific promoter constructions:
A
–
hypocotyl sections; B
–
callusogenesis; C
–
somatically regenerated embryo plants; D
–
rooting
and shooting; E
–
transferring into soil pots.
CONCLUSION
On the basis of the performed investigation on the theme of this doctoral
dissertation “Cloning, characterization and investigation of molecular evolution of
pathogen-resistance cluster
MIC-3
gene family in cotton (
Gossypium
ssp
.
) and its
significance for cotton biotechnology” the following conclusions were presented:
1. For the first time, the position, structure and content of the complex, large,
only cotton specific, and root expressed
MIC-3
gene family of
Gossypium
species
were cloned, sequenced and characterized in allotetraploid and diploid cotton
genomes.
2. The results identified a total of 169
MIC-3
gene member genomic DNA
sequences from 15 cotton genotypes and revealed 4 to 16 gene members with 2 to
10 subfamilies per studied genotype/species.
3. All
MIC-3
gene members were phylogenetically grouped into a total of 17
genome-specific subfamilies using nucleotide polymorphisms (SNPs) and putative
haplotypes.
4. The analysis of allotetraploid genome-derived
MIC-3
gene members
further identified 42 haplotype sequences, specific to A
t
- or D
t –
genomes, that
helped to identify
MIC-3
gene specific SNPs.
5. For the first time, genome specific
MIC-3
-derived SNP markers were
developed, and haplotypic associations and long-PCR experiments have confirmed
clustered localizations of
MIC-3
gene members in homeologous segments of
chromosomes 4 and 19 of
G. hirsutum
.
6. For the first time, nucleotide substitution rates and patterns of molecular
evolution of
MIC-3
multigene family in 15 tetraploid and diploid cotton genotypes
were reported. Estimation of an average number of synonymous (d
S
) and
65
nonsynonymous (d
N
) nucleotide substitutions for coding DNA sequences of
MIC-3
gene family detected selective constraints and molecular evolution of this gene
family in cotton genomes.
7. The results suggested that, despite an early-course, “concerted” evolution
may be evident,
MIC-3
gene family of cotton species were evolving under a “birth
and-death” evolution with purifying selection in exon-1 and diversifying selection
in exon-2.
8. The results also suggested “gene amplification” as a possible mechanism to
preserve all duplicate copies of
MIC-3
genes and to develop new gene functions
during cotton plant defenses under “bait and switch” model.
9. The results indicated
MIC-3
gene duplication events occurred at various
rates, once per ~1 million years (MY) in the allotetraploids, once per ~2 MY in the
A/F genome clade, and once per ~8 MY in the D-genome clade. The identified
intriguing time estimate and gene duplication pattern should be useful to
understand the role of pathogen-mediated selection processes in the evolution of
cotton genomes;
10. It was shown that
MIC-3
genes are highly expressed during
Fusiarium
and
Verticillium
wilt infection process in susceptible and resistant genotypes of cotton
cultivars that show the significance of
MIC-3
genes during wilt diseases of cotton.
11. For the first time, 2.5 kb intergenic spacer region containing a
MIC-3
promoter with root-specific signal sequence was cloned, sequenced and
characterized.
12. A set of several binary genetic vectors, driving
GUS
marker gene under
various lengths of
MIC-3
promoter sequences, as well as binary vectors with
syntetic RNAi duplexes to study plant gen function, including
MIC-3
genes, were
constructed and transformed into model plant Arabidopsis that identified and
confirmed root specificity of minimally required
MIC-3
gene promoter sequences
useful for future cotton biotechnology.
66
ЭЪЛОН ҚИЛИНГАН ИШЛАР РЎЙХАТИ
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
LIST OF PUBLISHED WORKS
I бўлим (I часть; Part I)
1. Буриев З.Т., Бозоров Т.А., Абдурахмонов И.Ю., Якубов М.Д.,
Абдукаримов А. Соматический эмбриогенез и регенерация хлопчатника
(
Gossypium hirsutum
. L) сорта Кокер-312 // Доклады Академии Наук РУз. –
Ташкент, 2008. – №2. – С. 80-83. (03.00.00; № 2).
2. Абдурахмонов И.Ю., Бозоров Т.А., Буриев З.Т., Шерматов Ш.Э.,
Абдукаримов А. РНК-интерференция гена
HY5
хлопчатника в модельном
растении Арабидопсис // Узбекский биологический журнал. – Ташкент, 2008.
– Специальный выпуск. – С. 18-21. (03.00.00; № 5).
3. Buriev Z.T., Saha S., Abdurakhmonov I.Y., Jenkins J.N., Abdukarimov A.,
Scheffler B.E., Stelly D.M. Clustering, haplotype diversity, and locations of
MIC 3
,
a unique root-specific defence-related gene family in Upland Cotton (
Gossypium
hirsutum
L) // Theoretical and AppliedGenetics. – Berlin, 2009. –№120(3). –P.
587-606 (Research gate, 40, IF=3,85).
4. Abdurakhmonov I.Y., Saha S., Jenkins J.N., Buriev Z.T., Shermatov S.E.,
Scheffler B.E., Pepper A.E., Yu J.Z., Kohel R.J., Abdukarimov A. Linkage
disequilibrium based association mapping of fiber quality traits in
G.hirsutum
L.
variety germplasm // Genetica. – Berlin, 2009. – №136(3). –P. 401-17. (Research
gate, 40, IF=1,37).
5. Abdurakhmonov I.Y., Buriev Z.T., Logan-Young C.J., Abdukarimov A.,
Pepper A.E. Duplication, divergence and persistence in the Phytochrome
photoreceptor gene family of cottons (
Gossypium spp
.) // BMC Plant Biology. –
USA, 2010. – №10. –P. 119. (Research gate, 40, IF=4,99).
6. Буриев З.Т., И.Ю. Абдурахмонов, Ш. Э. Шерматов, А. Абдукаримов
Молекулярная характеристика семейства генов
MIC-3
рода
Gossypium
//
Доклады Академии Наук РУз. – Ташкент, 2010. – №6. – С. 73-75. (03.00.00; №
2).
7. Buriev Z.T., Saha S., Shermatov S.E., Jenkins J.N., Abdukarimov A, Stelly
D.M., Abdurakhmonov I.Y. Molecular evolution of the clustered
MIC-3
multigene
family of Gossypium species // Theoretical and Applied Genetics.–Berlin,2011. –
№123(8). –P. 1359-73. (Research gate, 40, IF=5.29).
8. Abdurakhmonov I.Y., Buriev Z.T., Saha S., Jenkins J.N., Abdukarimov A.,
Pepper A.E. Cotton PHYA1 RNAi enhances major fiber quality and agronomic
traits of cotton (
Gossypium hirsutum
L) // Nature Communications. – USA, 2014.
– №4. 1-10 (Research gate, 40, IF=12,51).
9. Буриев З.Т., Абдурахмонов И.Ю. Сравнение скоростей
несинонимичных и синонимичных нуклеотидных замен генов
MIC-3
у
хлопчатника // Узбекский биологический журнал. – Ташкент, 2016. –
Специальный выпуск. – С. 37-40. (03.00.00, № 5).
10. Буриев З.Т., Абдурахмонов И.Ю., Шерматов Ш.Э., Рузибаев Х.С.,
Абдукаримов А. Хромосомная локализация генов
MIC-3
хлопчатника //
67
Узбекский биологический журнал. – Ташкент, 2016. – Специальный выпуск.
– С. 33-37. (03.00.00; № 5).
11.
Патент
Республики Узбекистан № IAP 04300. Малая
интерферирующая РНК (siRNA) для подавления генной экспрессии в
растительных клетках / Абдукаримов А., Абдурахмонов И.Ю., Буриев З.Т.,
Бозоров Т.А. // Официальный бюллетень. – 2011. – № 2.
12. Патент Республики Узбекистан № IAP 04383. Малая
интерферирующая РНК (siRNA) для подавления генной экспрессии в
растительных клетках / Абдукаримов А., Абдурахмонов И.Ю., Буриев З.Т.,
Бозоров Т.А.// Официальный бюллетень. – 2011. – № 2.
13. Патент Республики Узбекистан № IAP 04360. Малая
интерферирующая РНК (siRNA) для подавления генной экспрессии в
растительных клетках / Абдукаримов А., Абдурахмонов И.Ю., Буриев З.Т.,
Бозоров Т.А.// Официальный бюллетень. – 2011. –№ 6.
14. Патент Республики Узбекистан № IAP 04361. Малая
интерферирующая РНК (siRNA) для подавления генной экспрессии в
растительных клетках / Абдукаримов А., Абдурахмонов И.Ю., Буриев З.Т. //
Официальный бюллетень, – 2011. – № 6.
II бўлим (II часть; Part II)
15. Buriev, Z., Saha, S., Abdurakhmonov, I.Y., Jenkins, J.N., Abdukarimov,
A., Scheffler, B.E., Stelly, D.M., Wubben, M. A strategy for developing snp
markers for the
MIC-3
root-specific gene family associated with nematode
resistance in
Gossypium
spp. // Proceedings International Cotton Genome Initiative
Conference. Available: http: cgi.tamu.edu\pds\icgi06-abs-final. 2006.
16. Buriev, Z., Saha, S., Abdurakhmonov, I.Y., Jenkins, J.N., Abukarimov, A.,
Scheffler, B.E., Stelly, D.M., Wubben, M. 2006. Evidence of clustering for the
MIC-3
root-specific gene family associated with nematode resistance in
Gossypium spp. American Society of Agronomy Abstracts. CDROM.
17. Бозоров Т.А., Абдурахмонов И.Ю., Буриев З.Т., Абдукаримов А.А.
Создание RNAI конструкции. // Актуальные проблемы молекулярной
биологии растений: Материалы международной научно-практической
конференции: Ташкент, 2008. – С. 25-26 .
18. I.Y. Abdurakhmonov, Z.T. Buriev, S.E. Shermatov, G.T. Mavlonov, A.
Abdukarimov. Molecular diversity and population structure analysis in a global set
of
G. hirsutum
exotic and variety germplasm resources and association mapping of
the main fibre quality traits // Proceedings of the International Cotton Genome
Initiative Conference. – Canberra. - 2010. – P.22.
19. Buriev Z.T., Saha S., Jenkins J.N., Shermatov S.E., Abdukarimov A,
Stelly D.M., Abdurakhmonov I.Y. Molecular evolution of clustered
MIC-3
(Meloidogyne Induced Cotton-3) multigene family of
Gossypium
species. //
Proceedings of the International Cotton Genome Initiative Conference. – Canberra,
2010. – P.66.
20. Буриев З.Т., Абдурахмонов И.Ю., Шерматов Ш.Э., Абдукаримов А.
Характеристика семейства генов
MIC-3
у вида GOSSYPIUM // Биология –
68
Наука ХХI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция
молодых ученых. – Пущино, 2010. – С.115.
21. БуриевЗ.Т. Изучение нуклеотидных последовательностей семейства
генов
MIC-3
рода
Gossypium
// Ғўзанинг дунѐвий хилма-хиллиги генофонди
фундаментал ва амалий тадқиқотлар асоси: халқаро илмий анжуман
материаллари. – Ташкент, 2010. – С. 167
22. Buriev Z.T., Shermatov S.E., Abdurakhmonov I.Y. Function and
molecular evolution of
MIC-3
gene family of cotton. // Актуальные проблемы
развития биоорганической химии. Материалы международной научной
конференции. – Ташкент, 2010. – С. 148.
23. Abdurakhmonov I.Y., Buriev Z.T., Shermatov S.E. Marker-assisted
selection for complex fiber traits in cotton // 5
th
World Cotton Research
Conference, Special session of ICGI. – Mumbai, India: 2011. P. 406
24. Buriev Z.T., Saha S, Jenkins J.N., Shermatov S.E., Abdukarimov A,
Stelly D.M., Abdurakhmonov I.Y. Molecular evolution of clustered
MIC-3
(Meloidogyne Induced Cotton-3) multigene family of
Gossypium
species. // World
Cotton Research Conference-5. – Mumbai, India, 2011. P. 412
25. Abdurakhmonov I.Y., Buriev Z.T., Sukumar S., Abdukarimov A., Jenkins
J., Pepper A. Phytochrome RNA interference enhances major fiber quality and
agronomic traits of cotton (
Gossypium hirsutum
L.). // ICGI conference. –Raleigh,
NC, 2012.
26. Patent Application of Uzbekistan № IAP: 20120069, Patent Application
of USA № USPTO:13/445696, Patent Application of internationally №
PCT/US13/27801. Cotton
PHYA1
RNAi Improves Fiber Quality, Root Elongation,
Flowering, Maturity and Yield Potential in
Gossypium hirsutum
L /
Abdurakhmonov I.Y., Buriev Z.T., Saha S., Jenkins J.N., Abdukarimov A., Pepper
A.E. // – 2012.
27. Abdurakhmonov I.Y., Shapulatov U.M., Shermatov S.E., Buriev Z.T.,
Abdullaev A.A., Kushanov F.N., Egamberdiev S.S., Salahutdinov I.B.,
Ubaydullaeva H.A., Makamov A.H., Darmanov M.M., Ayubov M.S., Norov T.M.,
Tulanov A.A., Mavlonov G.T., Abdukarimov A. Achievements and perspectives
of cotton “omics” in Uzbekistan: // Proceedings of the International Cotton
conference Bremen. – Germany, 2014. – P. 47-63
28. Буриев З.Т., Абдурахмонов И.Ю. Молекулярное разнообразие и
дифференциация мультигенного семейства
MIC-3
хлопчатника //
Современные проблемы генетики, геномики и биотехнологии: Материалы
Республиканская научная конференция: – Тошкент: 2016 – C. 78.
69
Автореферат «Тил ва адабиѐт таълими» журнали таҳририятида
таҳрирдан ўтказилди.
Босишга рухсат этилди: 08.11.2016 йил
Бичими 60х45
1
/
16
, «Times New Roman»
гарнитурада рақамли босма усулида босилди.
Шартли босма табоғи 5. Адади: 100. Буюртма: № _____.
Ўзбекистон Республикаси ИИВ Академияси,
100197, Тошкент, Интизор кўчаси, 68
«АКАДЕМИЯ НОШИРЛИК МАРКАЗИ» ДУК
70
